ヒト多能性幹細胞からの腸管神経系系統の分化

要約

ヒト多能性幹細胞(hPSC)から腸神経系(ENS)系統を導出することで、ENSの発生と疾患を研究し、再生医療で使用するためのスケーラブルな細胞源を提供します。ここでは、化学的に定義された培養条件を使用してhPSCから腸管ニューロンを誘導するための詳細な in vitro プロトコルを示します。

要約

ヒトの腸管神経系ENSは、神経伝達物質の多様性が顕著なグリア細胞とニューロン細胞の大規模なネットワークです。ENSは、腸の運動性、酵素分泌、栄養素の吸収を制御し、免疫系や腸内細菌叢と相互作用します。その結果、ENSの発達および後天性の欠陥は、多くのヒトの病気の原因であり、パーキンソン病の症状に寄与する可能性があります。動物モデルシステムにおける制限と初代組織へのアクセスは、ヒトENSの研究において大きな実験的課題を提起しています。ここでは、定義された培養条件を使用して、ヒト多能性幹細胞であるhPSCからENS系統を効果的にin vitro で誘導するための詳細なプロトコルを示します。私たちのプロトコルは、15日以内にhPSCを腸管神経堤細胞に特異的に分化することから始まり、30日以内に機能的な腸管ニューロンの多様なサブタイプを生み出します。このプラットフォームは、開発研究、疾患モデリング、創薬、再生アプリケーションのためのスケーラブルなリソースを提供します。

概要

腸管神経系(ENS)は、末梢神経系の最大の構成要素です。ENSには、消化管内に位置し、腸のほぼすべての機能を制御する4億個以上のニューロンが含まれています¹。ENSの発生と機能、および腸管性ニューロパチーにおけるその欠陥の分子的理解には、腸管ニューロンの信頼できる本物の供給源へのアクセスが必要です。ヒトの初代組織へのアクセスは限られており、動物モデルは多くの腸内ニューロパチーの主要な疾患表現型を再現できていません。ヒト多能性幹細胞(hPSC)技術は、特に一次供給源2,3,4,5,6,7から単離が困難な細胞種を無制限に供給する上で非常に有益であることが証明されています。ここでは、hPSCからENS培養物を得るための段階的かつ堅牢なin vitro法について詳しく説明します。これらのスケーラブルなhPSC由来培養物は、発生研究、疾患モデリング、ハイスループット薬物スクリーニングへの道を開き、再生医療のための移植可能な細胞を提供することができます。

腸管ニューロン系統は、胚形成中のENS発生経路をたどる神経堤(NC)細胞に由来します。胚では、NC細胞は折り畳み式の神経板の縁に沿って出現します。それらは増殖し、移動し、感覚ニューロン、シュワン細胞、メラノサイト、頭蓋顔面骨格、腸内ニューロン、グリア^8,9,10など、さまざまな細胞タイプを生じさせます。細胞の運命決定は、NC細胞が出現する前後軸に沿った明確な領域、すなわち、頭蓋NC、迷走神経NC、体幹NCおよび仙骨NCに依存する。ENSは迷走神経および仙骨のNC細胞から発生し、前者は腸の長さに沿って広範囲に移動し、腸にコロニーを形成するため、腸内ニューロンの集団を支配します¹¹。

PSCからのNC細胞の誘導には、一般に、デュアルSMAD阻害とWNT経路活性化の組み合わせが含まれます^12,13。最近まで、すべてのNC誘導プロトコルには、培養条件に血清やその他の動物製品添加物が含まれていました。化学的に未定義の媒体は、NC誘導の再現性を低下させるだけでなく、機構的な発生研究にも課題をもたらします。これらの課題を克服するために、Barberら¹⁴は、化学的に定義された培養条件を用いたNC誘導プロトコルを開発し、したがって、血清置換因子(例えば、KSR)^13,14に依存する代替方法よりも有利であった。これは、基礎培地の置換と、hPSCから腸管NC細胞を誘導するためにFattahiらによって最初に提示されたプロトコルの最適化によって得られました。この改良されたシステムは、ここで紹介するhPSC分化プロトコルの基礎です。これは、レチノイン酸(RA)に加えてBMP、FGF、WNT、TGFβシグナル伝達の正確な調節により、15日間で腸管神経堤(ENC)細胞を誘導することから始まります。次に、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)で細胞を処理することにより、ENS系統を導き出します。すべての培地組成物は化学的に定義されており、30〜40日以内に堅牢な腸内ニューロン培養物が得られます。

ここで述べた単層細胞培養系に加えて、自由浮遊胚様体^15,16を用いた代替のNC誘導法が開発されている。これらの培養物中の遊走性細胞は、迷走神経NCを表すサブセットでNCマーカーを発現することが示されています。初代腸組織との共培養は、これらの培養物の腸内NC前駆体を濃縮するために使用されてきました。これらの研究における培地組成物には、神経成長因子、NT3、脳由来神経栄養因子などのさまざまな因子の組み合わせが含まれています。この段階では、これらの要因が腸内ニューロン前駆体のコミットメントのアイデンティティにどのように影響するかは完全には明らかではありません。単分子膜と胚様体ベースの培養における腸内NC誘導を効率的に比較するには、より多くのデータが必要です。これらの戦略ではカルチャのレイアウトが異なるため、各方法の使用を検討し、特定のアプリケーションを念頭に置いて最適化する必要があります。

ここで提示されたプロトコルは再現性があり、異なるhPSC(誘導および胚)系統^8,14,16を用いて、我々および他の者によって成功裏に試験されている。

プロトコル

1. 培地の準備

注:プロトコール全体で言及されている濃度は、培地成分の最終濃度です。すべての培地を無菌条件下で層流フードで調製し、暗所で4°Cで保存します。2週間以内にご使用ください。

1. hPSC維持培地:フィーダーフリーのhPSC維持培地サプリメント(20μL / mL)とそのベース培地を混合します。
2. 培地A:骨形成タンパク質4(BMP4;1 ng/mL)、SB431542(10 μM)、CHIR99021(600 nM)を分化ベース培地に添加します。
3. 培地B:分化ベース培地にSB431542(10μM)とCHIR99021(1.5μM)を添加します。
4. C培地:分化ベース培地にSB431542(10μM)、CHIR99021(1.5μM)、RA(1μM)を添加します。
5. ニューラルクレストコンプリート(NCC)培地:FGF2(10 ng/mL)、CHIR99021(3 μM)、N2サプリメント(10 μL/mL)、B27サプリメント(20 μL/mL)、L-グルタミンサプリメント(10 μL/mL)、およびMEM NEAA(10 μL/mL)をニューロベース培地に加えます。
6. ENC培地:GDNF(10 ng / mL)、アスコルビン酸(100 μM)、N2サプリメント(10 μL / mL)、B27サプリメント(20 μL / mL)、L-グルタミンサプリメント(10 μL / mL)、およびMEM NEAA(10 μL / mL)を神経基礎培地に加えます。
7. エチレンジアミン四酢酸(EDTA)1x:PBSで500 mM EDTA(1000x)を最終濃度500 μMに希釈します。
   注:特に明記されていない限り、このプロトコル全体でCa²⁺ およびMg²⁺ 遊離PBSを使用してください。

2. 培養プレートのコーティング

1. 基底膜マトリックスコーティングプレート:500 mLの血清ピペットを使用して激しくピペッティングすることにより、基底膜マトリックスの500 μL凍結アリコートを50 mLの冷却DMEM:F12で迅速に解凍し、希釈します。希釈した基底膜マトリックス溶液(ウェル表面積1cm² あたり100 μL)でウェルをコーティングし、37°Cで一晩インキュベートします。 使用前にコーティング媒体を吸引してください。基底膜マトリックスの糊化を防ぐために、この手順をできるだけ早く実行し、凍結アリコートを溶解するために冷たいDMEM:F12を使用してください。
   注:凝固を防ぐために、融解中(氷上)および分注中(氷上のチューブ)は、基底膜マトリックスの温度を冷たく保つ必要があります。
2. PO/FN/ラミニンコーティングプレート:PBS中の15 μg/mLポリオルニチン(PO)溶液を調製し、ストックを1000倍に希釈します。ウェル表面積1 cm² あたり100 μLのPO/PBS溶液でウェルをコーティングし、プレートを37°Cで一晩インキュベートします。 翌日、PO/PBSを吸引し、2 μg/mLのフィブロネクチン(FN)と2 μg/mLのラミニンを含む新しく作ったFN/ラミニン/PBS溶液で、ウェル表^面積100 μL/cm2でウェルをコーティングします。プレートは、37°Cで最低2時間のインキュベーション後に使用できます。 使用前にFN /ラミニン/ PBSを吸引してください。

3. hPSC培養の維持

注:すべての細胞インキュベーションステップは、加湿インキュベーター内で5%_CO2 および37°Cで行われます。

1. hPSC培養物からhPSC培地を吸引し、コロニーが~80%コンフルエントになるまで、新鮮な培地(ウェル表面積1 cm² あたり200 μL)を隔日で追加します。
2. 継代するには、hPSC培地を吸引し、ウェル表面積^1cm2 あたり100μLのPBSで細胞を洗浄します。
   注:細胞を洗浄するために^Ca2+ および^Mg2+ 遊離PBSを使用することが重要です。
3. 500 μM EDTA(ウェル表面積1 cm² あたり100 μL)を添加します。プレートの蓋を元に戻します。倒立顕微鏡で観察し、コロニーエッジの細胞の剥離を監視します(2〜4分)。
4. 5 mLまたは10 mLの血清ピペットを使用して、同量のhPSC培地を各ウェルに移し、数回ピペッティングして細胞を機械的に回収します。
   注:最適なEDTAインキュベーション時間は、iPS細胞ラインによって異なります。分離するコロニーの激しいピペッティングは、コロニーの過度の解離や細胞死につながる可能性があるため、避けてください。分化プレートを開始するために継代するときは、EDTAで細胞を1〜2分長くインキュベートします。
5. 細胞懸濁液を15mLのコニカルチューブに移します。細胞を回転させ(2分、290 x g、20-25°C)、上清を慎重に捨てます。
6. 細胞を適切な容量のhPSC培地に再懸濁し、新しい基底膜マトリックスコーティングプレートのウェルに移します。
   注:定期的なhPSCメンテナンスには、1:18〜1:24の継代比を使用してください(1:18は、6ウェルプレートの1つのウェルから解離した細胞の3分の1を完全な新しいプレートに移すことを意味します)。差別化プレートを開始するには、5:6の継代比に従います。
7. 5% CO₂ および37°Cでインキュベートします。

4. 神経堤誘導

注: この手順を 図 1A に概略的に示しています。NC分化は、細胞が約80%コンフルエントになったら開始します。これは、細胞が5:6の比率で継代されると、1〜2日以内に達成されます(上記参照)。0日目に、多能性および完全に未分化のhPSC細胞を用いてNC分化を開始します。高効率のためには、コロニー境界は最小限の分化細胞を持つべきです。コロニーが大きい場合、または倒立顕微鏡を使用して監視するとコロニーの中心が肥厚/暗くなり始める場合の鑑別のための通路およびプレートhPSC。コンフルエンシーと形態に注意を払うことは、細胞株によって異なり、cm²あたり50,000〜200,000の間で変動する可能性があるため、播種した細胞の数よりも信頼性が高い傾向があります。

1. 0日目に、hPSC維持培地を、1 ng/mL BMP4、10 μM SB431542、600 nM CHIR99021(ウェル表面積1 cm² あたり200 μLの培地)を含む培地Aと交換します。
2. 2日目には、細胞は100%コンフルエントであるべきです。使用済みの培地Aを穏やかに吸引し、10 μM SB431542、1.5 μM CHIR99021(ウェル表面積1 cm² あたり200 μLの培地)を含む培地Bを細胞に供給します。
   注:NC誘導中に培養物が増殖すると、細胞が下にある単層から剥離する可能性があります。古い培地を静かに取り除き、ウェルの側面に新しい培地を追加することで、過剰な細胞損失を回避します。
3. 4日目に、培地B(ウェル表面積1cm² あたり200μLの培地)を再び細胞に供給します。
4. 6日目に、培地Bを、10 μM SB431542、1.5 μM CHIR99021、1 μMのレチノイン酸(ウェル表面積1 cm² あたり400 μLの培地)を含む培地Cと交換します。
5. 8日目と10日目は、6日目として給餌します。

5. ENCスフェロイドの形成

注: この手順を 図 1B に概略的に示しています。

1. 12日目に、ミディアムCを穏やかに吸引し、ウェル表面積^1cm2 あたり100μLのPBSで細胞を洗浄します。同量の細胞剥離溶液を添加し、5% CO₂ および37°Cで30分間インキュベートします。
2. 10 ng/mL FGF2、3 μM CHIR99021、10 μL/mL N2 サプリメント、20 μL/mL B27 サプリメント、10 μL/mL L-グルタミンサプリメント、10 μL/mL MEM NEAA を含む同量の NCC 培地を添加して、細胞剥離溶液を希釈します。血清学的ピペットを使用して、単一細胞懸濁液を回収し、15 mLのコニカルチューブに加えます。
3. 細胞を回転させ(2分、290 x g、20-25°C)、上清を慎重に捨てます。
4. 10 mLの血清ピペットを使用して、12 mL(フル6ウェルプレートの場合)のNCC培地を加え、機械的に1〜2回ピペッティングして細胞を完全に再懸濁します。細胞懸濁液を超低接着プレートに移します。
   注:約10 cm² のENC単層細胞を2 mLのNCC培地に再懸濁し、超低接着プレートの1ウェルに移します。これは、フル6ウェルNCインダクションプレートをフル6ウェル超低アタッチメントプレートに移したのと同じです。
5. 14日目に、小さな回転楕円体が各ウェルの中央に集まるまで、プレートを静かに渦巻かせます。P1000マイクロピペットを使用し、ゆっくりと円を描くように、使用済みのNCC培地を各ウェルの周囲で吸引します。浮遊性スフェロイドは取り除かないようにしてください。
6. 元の容量のNCC培地を細胞に供給します。

6. ENインダクション

注: この手順を 図 1B に概略的に示しています。

1. 15日目に、14日目と同じ手法を適用して培地を静かに取り出し、PBSでスフェロイドを洗浄します。回転楕円体を避けて、できるだけ多くのPBSを取り除きます。
2. 細胞剥離溶液(ウェル表面積1cm² あたり100 μL)を添加し、5% CO₂ および37°Cで30分間インキュベートすることにより、スフェロイドを単一細胞に解離します。
3. 10 mLの血清ピペットを使用して、等量のENC培地(10 ng/mL GDNF、100 μMアスコルビン酸、10 μL/mL N2サプリメント、20 μL/mL B27サプリメント、10 μL/mL L-グルタミンサプリメント、および10 μL/mL MEM NEAAをニューロベース培地に含有)を各ウェルに加え、残りのスフェロイドを2〜3ラウンドの機械式ピペッティングで切断します。細胞を50mLのコニカルチューブに移します。
   注:強制ピペッティングや先端開口部の小さいピペットの使用により発生する可能性のある過度のストレスや細胞死は避けてください。
4. 細胞を回転させ(2分、290 x g、20-25°C)、上清を慎重に捨てます。10 mLの血清ピペットを使用して、5~10 mLのENC培地を加え、ピペッティングを1〜2回行って細胞を完全に再懸濁します。
5. トリパンブルーと血球計算盤などの細胞計数法を使用して、生細胞の濃度をカウントします。
   注意:トリパンブルーは発がん性が疑われる物質です。取り扱いには注意し、適切に廃棄してください。
6. 表面積^{cm 2} あたり約 300,000 〜 400,000 個の生細胞を、mL あたり約 ~ 1,000,000 個の細胞の密度でプレートすることを目的として、十分な量の ENC 培地を追加します。プレートのウェルからFN/ラミニン/PBS溶液を吸引します。
   注:この段階はプロトコルの最終的な再めっきステップを示すため、EN培養用に計画されているアッセイに従ってプレート形式を選択してください。腸内ニューロン前駆細胞は15日目に凍結することができます。球体を細胞剥離溶液で解離した後、前駆細胞を約5 x 10⁶ 細胞/mLで10% DMSOやStem-cellbankerなどの凍結培地に再懸濁します。必要に応じて、5 μM Y-27632 ROCK阻害剤を含む温かいENC培地で解凍します。目的のプレート形式のプレートセル。数時間後にメディアを新しいENCと交換します。
7. 細胞をPO/FN/ラミニンでコーティングしたウェルに穏やかに加えます。特に384ウェルプレートのような小さなウェルサイズのプレートを使用する場合、気泡が細胞懸濁液の下に閉じ込められるのを防ぎ、細胞がPO/FN/ラミニンコーティングに付着するのを防ぎます。これは細胞死につながる可能性があります。
8. 30〜40日目までENC培地(ウェル表面積^1cm2 あたり200μL)を隔日で細胞に給餌し、その後、給餌頻度を減(週に1〜2回)減らしますが、給餌量は2倍にします(ウェル表面積^1cm2 あたり培地400μL)。
   注:培地を過度に除去および添加すると、ウェルの表面からのニューロン培養物の剥離が促進される可能性があるため、これは重要です。特に長期培養では、剥離を前向きに防ぐために、ENCにFN(2 μg/mL)とラミニン(2 μg/mL)を週に1回補給します。

結果

このプロトコルは、化学的に定義された培養条件を使用して、hPSCから腸管神経堤および腸管ニューロンを導出する方法を提供します(図1A-B)。高品質のニューロンを生成するには、効率的な腸管神経堤誘導ステップが必要です。これは、図1Cに示すように、約0.1〜0.4mmのサイズの滑らかな表面で丸く見えるはずの自由浮遊球の形態を確認...

ディスカッション

ここで述べる分化プロトコルは、30〜40日以内にhPSCから腸管ニューロンを得るための頑健なin vitro法(図1E)と、古い培養物でグリア線維性酸性タンパク質、GFAP、およびSOX10を発現する腸グリアを得るための堅牢なインビトロ法を提供する(>55日目)^13,14,19,22。これらのニュ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A)	Gibco	12587-010
Basement membrane matrix, Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R&D systems	314-BP
Cell culture centrifuge	Eppendorf, model no. 5810R	02262501
Cell detachment solution, Accutase	Stemcell Technologies	07920
CHIR99021	Tocris	4423
Conical tubes	USA scientific	1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6	Life Technologies	A1516401
DMEM/F-12 no glutamine	Life Technologies	21331020
EDTA	Corning	MT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit	Life Technologies	A2858501
FGF2	R&D systems	233-FB/CF
Fibronectin	Corning	356008
GDNF	Peprotech	450-10
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESC	WiCell	RRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2	Thermo Fisher Scientific	Herralcell 150i
Inverted microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Laminar flow hood	Thermo Fisher Scientific	1300 series class II, type A2
Laminin	Cultrex	3400-010
L-glutamine supplement, Glutagro	Corning	25-015-CI
MEM NEAAs	Corning	25-025-CI
Multiwell plates, Falcon	BD	353934, 353075
N-2 Supplement	CTS	A1370701
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
PBS (Ca and Mg free)	Life Technologies	10010023
Pipette filler	Eppendorf	Z768715-1EA
Pipette tips	USA scientific	1111-2830
Pipettes	Fisherbrand	13-678-11E, 13-678-11F
PO	Sigma-Aldrich	P3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi	ibidi	81156
RA	Sigma-Aldrich	R2625
SB431542	R&D systems	1614
Trypan blue stain, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Ultra-low attachment plates	Fisher Scientific	07-200-601
Y-27632 dihydrochloride	R&D systems	1254