Differenziazione delle linee del sistema nervoso enterico dalle cellule staminali pluripotenti umane

Riepilogo

La derivazione di linee del sistema nervoso enterico (ENS) da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) fornisce una fonte scalabile di cellule per studiare lo sviluppo e la malattia dell'ENS e per l'uso nella medicina rigenerativa. Qui viene presentato un protocollo dettagliato in vitro per derivare neuroni enterici da hPSC utilizzando condizioni di coltura chimicamente definite.

Abstract

Il sistema nervoso enterico umano, ENS, è una vasta rete di tipi di cellule gliali e neuronali con una notevole diversità di neurotrasmettitori. L'ENS controlla la motilità intestinale, la secrezione enzimatica e l'assorbimento dei nutrienti e interagisce con il sistema immunitario e il microbioma intestinale. Di conseguenza, i difetti dello sviluppo e acquisiti dell'ENS sono responsabili di molte malattie umane e possono contribuire ai sintomi del morbo di Parkinson. Le limitazioni nei sistemi modello animale e l'accesso al tessuto primario pongono sfide sperimentali significative negli studi sull'ENS umano. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per un'efficace derivazione in vitro dei lignaggi ENS da cellule staminali pluripotenti umane, hPSC, utilizzando condizioni di coltura definite. Il nostro protocollo inizia con la differenziazione diretta delle hPSC in cellule della cresta neurale enterica entro 15 giorni e produce diversi sottotipi di neuroni enterici funzionali entro 30 giorni. Questa piattaforma fornisce una risorsa scalabile per studi sullo sviluppo, modellazione di malattie, scoperta di farmaci e applicazioni rigenerative.

Introduzione

Il sistema nervoso enterico (ENS) è il componente più grande del sistema nervoso periferico. L'ENS contiene più di 400 milioni di neuroni che si trovano all'interno del tratto gastrointestinale e controllano quasi tutte le funzioni dell'intestino¹. La comprensione molecolare dello sviluppo e della funzione dell'ENS e dei suoi difetti nelle neuropatie enteriche richiede l'accesso a una fonte affidabile e autentica di neuroni enterici. L'accesso al tessuto primario umano è limitato e i modelli animali non riescono a ricapitolare i fenotipi chiave della malattia in molte neuropatie enteriche. La tecnologia delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) si è dimostrata estremamente vantaggiosa nel fornire una fonte illimitata dei tipi di cellule desiderate, in particolare quelle che sono difficili da isolare da fonti primarie 2,3,4,5,6,7. Qui, forniamo i dettagli di un metodo in vitro graduale e robusto per ottenere colture ENS da hPSC. Queste colture scalabili derivate da hPSC aprono la strada per studi sullo sviluppo, modellazione della malattia e screening di farmaci ad alto rendimento e possono fornire cellule trapiantabili per la medicina rigenerativa.

Le linee neuronali enteriche derivano dalle cellule della cresta neurale (NC) che seguono il percorso di sviluppo dell'ENS durante l'embriogenesi. Negli embrioni, le cellule NC emergono lungo i margini della placca neurale ripiegata. Proliferano, migrano e danno origine a molti tipi di cellule diverse, tra cui neuroni sensoriali, cellule di Schwann, melanociti, scheletro craniofacciale e neuroni enterici e glia ^8,9,10. La decisione sul destino cellulare dipende dalla regione distinta lungo l'asse antero-posteriore da cui emergono le cellule NC, cioè NC cranica, NC vagale, NC del tronco e NC sacrale. L'ENS si sviluppa da cellule NC vagali e sacrali, con le prime che dominano la popolazione dei neuroni enterici a causa dell'estesa migrazione lungo la lunghezza dell'intestino e colonizzano l'intestino¹¹.

La derivazione di cellule NC da PSC comporta comunemente una combinazione di doppia inibizione SMAD e attivazione della via WNT^12,13. Fino a poco tempo fa, tutti i protocolli di induzione NC coinvolgevano siero e altri additivi di prodotti animali nelle condizioni di coltura. I terreni chimicamente indefiniti non solo riducono la riproducibilità dell'induzione di NC, ma mettono anche in discussione gli studi meccanicistici sullo sviluppo. Per superare queste sfide, Barber et al¹⁴ hanno sviluppato un protocollo di induzione NC utilizzando condizioni di coltura chimicamente definite ed è stato quindi vantaggioso rispetto ai metodi alternativi che si basano su fattori di sostituzione del siero (ad esempio, KSR)^13,14. Questo è stato ottenuto mediante sostituzioni di terreni basali e ottimizzando un protocollo originariamente presentato da Fattahi et al per derivare cellule NC enteriche da hPSC. Questo sistema migliorato è la base del protocollo di differenziazione hPSC qui presentato. Inizia con l'induzione delle cellule della cresta neurale enterica (ENC) in un periodo di 15 giorni mediante una modulazione precisa della segnalazione BMP, FGF, WNT e TGFβ oltre all'acido retinoico (RA). Quindi deriviamo i lignaggi ENS trattando le cellule con il fattore neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale (GDNF). Tutte le composizioni dei terreni sono chimicamente definite e producono robuste colture neuronali enteriche entro 30-40 giorni.

Oltre al sistema di coltura cellulare monostrato qui descritto, sono stati sviluppati approcci alternativi di induzione NC che utilizzano corpi embrioidi liberi fluttuanti^15,16. È stato dimostrato che le cellule migratorie in queste colture esprimono marcatori NC con un sottogruppo che rappresenta la NC vagale. Le co-colture con tessuto intestinale primario sono state utilizzate per arricchire i precursori enterici della NC in queste colture. Le composizioni dei media in questi studi contengono una combinazione di diversi fattori come il fattore di crescita nervoso, NT3 e il fattore neurotrofico derivato dal cervello. In questa fase, non è del tutto chiaro come questi fattori possano influenzare le identità di impegno dei precursori dei neuroni enterici. Per un confronto efficiente dell'induzione enterica delle NC nel monostrato e nelle colture basate su corpi embrioidi sono necessari ulteriori dati. Dati i diversi layout culturali in queste strategie, l'uso di ciascun metodo dovrebbe essere considerato e ottimizzato in base all'applicazione specifica in mente.

Il protocollo qui presentato è riproducibile ed è stato testato con successo da noi e da altri utilizzando diverse linee di hPSC (indotte ed embrionali) ^8,14,16.

Protocollo

1. Preparazione dei terreni

NOTA: Le concentrazioni menzionate nel protocollo sono concentrazioni finali dei componenti del fluido. Preparare tutti i terreni in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare e conservarli a 4 °C al buio. Utilizzare entro 2 settimane.

1. Terreno di mantenimento hPSC: Miscelare l'integratore di terreno di mantenimento hPSC senza alimentatore (20 μL/mL) con il suo terreno di base.
2. Terreno A: aggiungere la proteina morfogenetica ossea 4 (BMP4; 1 ng/mL), SB431542 (10 μM) e CHIR99021 (600 nM) al terreno di base di differenziazione.
3. Mezzo B: aggiungere SB431542 (10 μM) e CHIR99021 (1,5 μM) al mezzo di base di differenziazione.
4. Mezzo C: aggiungere SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1,5 μM) e RA (1 μM) al mezzo di base di differenziazione.
5. Terreno completo della cresta neurale (NCC): aggiungere FGF2 (10 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), integratore di N2 (10 μL/mL), integratore di B27 (20 μL/mL), integratore di L-glutammina (10 μL/mL) e MEM NEAAs (10 μL/mL) al terreno neurobasale.
6. ENC Medium: aggiungere GDNF (10 ng/mL), acido ascorbico (100 μM), integratore di N2 (10 μL/mL), integratore di B27 (20 μL/mL), integratore di L-glutammina (10 μL/mL) e MEM NEAAs (10 μL/mL) al terreno neurobasale.
7. Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 1x: diluire 500 mM di EDTA (1000x) a una concentrazione finale di 500 μM in PBS.
   NOTA: Utilizzare PBS libero da Ca²⁺ e Mg²⁺ in tutto questo protocollo, se non diversamente specificato.

2. Rivestimento di piastre di coltura

1. Piastre rivestite con matrice di membrana basale: Scongelare rapidamente e diluire un'aliquota congelata da 500 μl di matrice di membrana basale in 50 mL di DMEM:F12 refrigerato mediante pipettaggio energico con una pipetta sierologica da 50 mL. Rivestire i pozzetti con la soluzione diluita della matrice della membrana basale (100 μl per cm² di superficie del pozzetto) e incubarli per una notte a 37 °C. Aspirare il mezzo di rivestimento prima dell'uso. Per prevenire la gelatinizzazione della matrice della membrana basale, eseguire questo passaggio il più rapidamente possibile e utilizzare DMEM:F12 freddo per sciogliere l'aliquota congelata.
   NOTA: La temperatura della matrice della membrana basale deve essere mantenuta fredda durante lo scongelamento (su ghiaccio) e l'aliquotazione (provette su ghiaccio) per prevenire la coagulazione.
2. Piastre rivestite di PO/FN/laminina: Preparare una soluzione di poliornitina (PO) da 15 μg/mL in PBS diluendo un stock 1000x. Rivestire i pozzetti con 100 μL di soluzione PO/PBS per cm² di superficie del pozzetto e incubare le piastre per una notte a 37 °C. Il giorno seguente, aspirare PO/PBS e rivestire i pozzetti a 100 μL per cm² di superficie del pozzetto con una soluzione di FN/laminina/PBS appena preparata contenente 2 μg/mL di fibronectina (FN) e 2 μg/mL di laminina. Le piastre possono essere utilizzate dopo un minimo di 2 ore di incubazione a 37 °C. Aspirare FN/laminina/PBS prima dell'uso.

3. Mantenimento della coltura hPSC

NOTA: Tutte le fasi di incubazione delle cellule sono al 5% di CO₂ e a 37 °C in un incubatore umidificato.

1. Aspirare il terreno hPSC dalla coltura hPSC e aggiungere terreno fresco (200 μL per cm² di superficie del pozzetto) a giorni alterni fino a quando le colonie sono ~80% confluenti.
2. Per il passaggio, aspirare il terreno hPSC e lavare le celle con 100 μL di PBS per cm² di superficie del pozzetto.
   NOTA: È importante utilizzare PBS libero da Ca²⁺ e Mg²⁺ per lavare le cellule.
3. Aggiungere 500 μM di EDTA (100 μl per cm² di superficie del pozzetto). Riposizionare il coperchio della piastra. Osserva attraverso un microscopio invertito e monitora le cellule per il distacco dei bordi della colonia (2-4 minuti).
4. Utilizzare una pipetta sierologica da 5 o 10 ml per trasferire lo stesso volume di terreno hPSC in ciascun pozzetto e raccogliere meccanicamente le cellule pipettando su e giù alcune volte.
   NOTA: Il tempo di incubazione ottimale dell'EDTA dipende dalla linea iPSC. Evitare un pipettaggio vigoroso per il distacco delle colonie, in quanto può portare a un'eccessiva dissociazione delle colonie e alla morte cellulare. Quando si passa per iniziare una piastra di differenziazione, incubare le cellule con EDTA per 1-2 minuti in più.
5. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare le cellule (2 min, 290 x g, 20-25 °C) ed eliminare con cura il surnatante.
6. Risospendere le cellule in un volume appropriato di terreno hPSC e trasferirle nei pozzetti di una nuova piastra rivestita di matrice di membrana basale.
   NOTA: Per la manutenzione regolare dell'hPSC utilizzare un rapporto di passaggio 1:18 - 1:24 (1:18 significa trasferire un terzo delle cellule dissociate da un singolo pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in una nuova piastra completa). Per iniziare una piastra di differenziazione, seguire un rapporto di passaggio 5:6.
7. Incubare al 5% di CO₂ e 37 °C.

4. Induzione della cresta neurale

NOTA: Questo passaggio è rappresentato schematicamente nella Figura 1A. Inizia la differenziazione NC quando le cellule sono confluenti per circa l'80%. Ciò si otterrà entro 1-2 giorni quando le cellule vengono fatte passare con un rapporto 5:6 (vedi sopra). Iniziare la differenziazione NC il giorno 0 con cellule hPSC pluripotenti e completamente indifferenziate. Per un'elevata efficienza, i bordi delle colonie dovrebbero avere celle di differenziazione minime. Passaggio e piastra hPSC per la differenziazione quando le colonie sono grandi o il centro della colonia inizia ad ispessirsi/scurirsi se monitorato con un microscopio invertito. Prestare attenzione alla confluenza e alla morfologia tende ad essere più affidabile del numero di cellule piastre, poiché questo può variare a seconda della linea cellulare e può variare da 50.000 a 200.000 per cm².

1. Il giorno 0, sostituire il terreno di mantenimento hPSC con un terreno A contenente 1 ng/mL di BMP4, 10 μM SB431542, 600 nM CHIR99021 (200 μL di terreno per cm² di superficie del pozzetto).
2. Il giorno 2, le cellule dovrebbero essere confluenti al 100%. Aspirare delicatamente il terreno A esaurito e alimentare le cellule con il terreno B contenente 10 μM di SB431542, 1,5 μM CHIR99021 (200 μl di terreno per cm² di superficie del pozzetto).
   NOTA: Man mano che le colture crescono durante l'induzione NC, le cellule possono staccarsi dal monostrato sottostante. Evitare l'eccessiva perdita di cellule rimuovendo delicatamente i vecchi terreni e aggiungendo nuovi terreni sul lato del pozzetto.
3. Il giorno 4, alimentare nuovamente le celle con il terreno B (200 μl di terreno per cm² di superficie del pozzetto).
4. Il giorno 6, sostituire il terreno B con il terreno C contenente 10 μM di SB431542, 1,5 μM di CHIR99021 e 1 μM di acido retinoico (400 μl di terreno per cm² di superficie del pozzetto).
5. Nei giorni 8 e 10, somministrare come giorno 6.

5. Formazione di sferoidi ENC

NOTA: Questo passaggio è rappresentato schematicamente nella Figura 1B.

1. Il giorno 12, aspirare delicatamente il terreno C e lavare le celle con 100 μl di PBS per cm² di superficie del pozzetto. Aggiungere lo stesso volume di soluzione di distacco cellulare e incubare per 30 minuti al 5% di CO₂ e 37 °C.
2. Diluire la soluzione di distacco cellulare aggiungendo lo stesso volume di terreno NCC contenente 10 ng/mL di FGF2, 3 μM di CHIR99021, 10 μL/mL di integratore di N2, 20 μL/mL di integratore di B27, 10 μL/mL di L-glutammina e 10 μL/mL di MEM NEAA. Utilizzando una pipetta sierologica, prelevare la sospensione di una singola cellula e aggiungerla a una provetta conica da 15 mL.
3. Centrifugare le cellule (2 min, 290 x g, 20-25 °C) ed eliminare con cura il surnatante.
4. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere 12 mL (per una piastra completa a 6 pozzetti) di terreno NCC e risospendere completamente le cellule pipettando meccanicamente su e giù 1-2 volte. Trasferire la sospensione cellulare su una piastra di fissaggio ultrabassa.
   NOTA: Circa 10 cm² di cellule monostrato ENC vengono risospese in 2 mL di terreno NCC e trasferite in un pozzetto di una piastra di attacco ultra-bassa. Ciò equivale a una piastra di induzione NC a 6 pozzetti completa trasferita in una piastra di attacco ultra-bassa a 6 pozzetti.
5. Il giorno 14, agitare delicatamente le piastre fino a quando piccoli sferoidi non si sono raccolti al centro di ogni pozzetto. Utilizzando una micropipetta P1000 e con un lento movimento circolare, aspirare il terreno NCC esaurito attorno alla circonferenza di ciascun pozzetto. Cerca di evitare di rimuovere gli sferoidi fluttuanti.
6. Alimentare le cellule con il volume originale di terreno NCC.

6. Induzione EN

NOTA: Questo passaggio è rappresentato schematicamente nella Figura 1B.

1. Il giorno 15, applicare la stessa tecnica utilizzata il giorno 14 per rimuovere delicatamente il terreno e lavare gli sferoidi con PBS. Rimuovi quanto più PBS possibile evitando gli sferoidi.
2. Aggiungere la soluzione di distacco cellulare (100 μL per cm² di superficie del pozzetto) e dissociare gli sferoidi in singole cellule incubando per 30 minuti al 5% di CO₂ e 37 °C.
3. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere un volume uguale di terreno ENC (contenente 10 ng/mL di GDNF, 100 μM di acido ascorbico, 10 μL/mL di integratore di N2, 20 μL/mL di integratore di B27, 10 μL/mL di L-glutammina e 10 μL/mL DI MEM NEAA in terreno neurobasale) a ciascun pozzetto e rompere gli sferoidi rimanenti con 2-3 cicli di pipettaggio meccanico. Trasferire le cellule in una provetta conica da 50 mL.
   NOTA: Evitare l'eccessivo stress e la morte cellulare che possono verificarsi a causa del pipettaggio forzato o dell'uso di pipette con apertura del puntale più piccola.
4. Centrifugare le cellule (2 min, 290 x g, 20-25 °C) ed eliminare con cura il surnatante. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere ~ 5-10 mL di terreno ENC e risospendere completamente le cellule pipettando su e giù 1-2 volte.
5. Contare la concentrazione di cellule vitali utilizzando il blu di tripano e un metodo di conteggio delle cellule come un emocitometro.
   ATTENZIONE: Il blu di tripano è un sospetto cancerogeno. Maneggiare con cura, smaltire in modo appropriato.
6. Aggiungere un volume sufficiente di terreno ENC con l'obiettivo di piastrare circa 300.000-400.000 cellule vitali per cm² di superficie a una densità di circa ~ 1.000.000 di cellule per mL. Aspirare la soluzione FN/laminina/PBS dai pozzetti della piastra.
   NOTA: Scegliere il formato della piastra in base ai saggi pianificati per le colture EN, poiché questa fase segna la fase finale di ri-placcatura del protocollo. I progenitori dei neuroni enterici possono essere congelati il giorno 15. Dopo aver dissociato le sfere con la soluzione di distacco cellulare, risospendere i progenitori a circa 5 x 10⁶ cellule/mL in mezzo di congelamento come DMSO al 10% o Stem-cellbanker. Se necessario, scongelare in terreno ENC caldo con l'inibitore ROCK Y-27632 da 5 μM. Piastre nel formato di piastra desiderato. Sostituire il supporto con un nuovo ENC dopo un paio d'ore.
7. Aggiungere delicatamente le cellule nei pozzetti rivestiti di PO/FN/laminina. Evitare che le bolle rimangano intrappolate sotto la sospensione cellulare impedendo l'adesione delle cellule al rivestimento PO/FN/laminina, soprattutto quando si utilizzano piastre con pozzetti di dimensioni inferiori come le piastre a 384 pozzetti. Questo potrebbe portare alla morte cellulare.
8. Alimentare le celle a giorni alterni con terreno ENC (200 μL per cm² di superficie del pozzetto) fino al giorno 30-40, dopodiché ridurre la frequenza di alimentazione (a una o due volte alla settimana) ma raddoppiare il volume di alimentazione (a 400 μL di terreno per cm² di superficie del pozzetto).
   NOTA: Questo è importante in quanto un'eccessiva rimozione e aggiunta di terreni potrebbe facilitare il distacco della coltura neuronale dalla superficie dei pozzetti. Per prevenire in modo prospettico il distacco, soprattutto per le colture a lungo termine, integrare ENC con FN (2 μg/mL) e laminina (2 μg/mL) una volta alla settimana.

Risultati

Questo protocollo fornisce un metodo per derivare la cresta neurale enterica e i neuroni enterici dalle hPSC utilizzando condizioni di coltura chimicamente definite (Figura 1A-B). La generazione di neuroni di alta qualità dipende da un'efficiente fase di induzione della cresta neurale enterica. Questo può essere valutato visivamente controllando la morfologia delle sfere fluttuanti che dovrebbero apparire rotonde con superfici lisce con una dimensione di circa 0,1 - 0,4 mm...

Discussione

Il protocollo di differenziazione qui descritto fornisce un robusto metodo in vitro per ottenere neuroni enterici da hPSC entro 30-40 giorni (Figura 1E) e glia enterica che esprimono proteina acida fibrillare gliale, GFAP e SOX10 in colture più vecchie (> giorno 55)13,14,19,22. Questi neuroni e la glia sono indotti dalla differenziazione graduale delle hP...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A)	Gibco	12587-010
Basement membrane matrix, Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R&D systems	314-BP
Cell culture centrifuge	Eppendorf, model no. 5810R	02262501
Cell detachment solution, Accutase	Stemcell Technologies	07920
CHIR99021	Tocris	4423
Conical tubes	USA scientific	1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6	Life Technologies	A1516401
DMEM/F-12 no glutamine	Life Technologies	21331020
EDTA	Corning	MT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit	Life Technologies	A2858501
FGF2	R&D systems	233-FB/CF
Fibronectin	Corning	356008
GDNF	Peprotech	450-10
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESC	WiCell	RRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2	Thermo Fisher Scientific	Herralcell 150i
Inverted microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Laminar flow hood	Thermo Fisher Scientific	1300 series class II, type A2
Laminin	Cultrex	3400-010
L-glutamine supplement, Glutagro	Corning	25-015-CI
MEM NEAAs	Corning	25-025-CI
Multiwell plates, Falcon	BD	353934, 353075
N-2 Supplement	CTS	A1370701
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
PBS (Ca and Mg free)	Life Technologies	10010023
Pipette filler	Eppendorf	Z768715-1EA
Pipette tips	USA scientific	1111-2830
Pipettes	Fisherbrand	13-678-11E, 13-678-11F
PO	Sigma-Aldrich	P3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi	ibidi	81156
RA	Sigma-Aldrich	R2625
SB431542	R&D systems	1614
Trypan blue stain, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Ultra-low attachment plates	Fisher Scientific	07-200-601
Y-27632 dihydrochloride	R&D systems	1254