マウスにおける高反復低レベル爆風曝露のモデリング

要約

ここでは、マウスを用いて低強度のブラスト露光を繰り返し行う方法を紹介します。

要約

爆発性爆風への曝露は、被曝した人々の脳外傷の重大な危険因子です。大きな爆風が脳に与える影響はよく理解されていますが、軍事訓練中に発生するような小さな爆風の影響はあまり理解されていません。この小規模で低レベルの爆風曝露は、軍事占領や訓練のテンポによっても大きく異なり、数年にわたってほとんど曝露を経験しない部隊もあれば、数週間以内に数百人の被曝を経験する部隊もあります。動物モデルは、低レベルの爆風曝露後の損傷メカニズムと長期的な臨床的健康リスクの両方を特定するための重要なツールです。この広範囲の曝露を再現できるモデルは、これらの異なるリスクプロファイルにわたる急性および慢性の傷害の結果を通知するために必要です。

いくつかの低レベルの爆風曝露後の結果は、メカニズム研究のために簡単にモデル化できますが、キャリアを通じて発生する慢性的な曝露は、数週間から数か月にわたって頻繁に発生する反復曝露を伴う爆風損傷パラダイムによってより適切にモデル化できる可能性があります。ここでは、マウスで非常に反復的な低レベルの爆風曝露をモデル化する方法を示します。この手順は、オープンフィールドブラスト露光の確立された広く使用されている空気圧ショックチューブモデルに基づいており、過圧パラメータと露光の数または間隔を調整するためにスケーリングできます。これらの方法は、その後、メカニズム調査を可能にするか、研究中の臨床グループの日常的な爆風曝露を再現するために使用できます。

概要

低レベル爆風(LLB)曝露は、個人または構造物が比較的低い規模の爆発力を経験したときに発生し、通常は小規模な労働災害、制御解体、または特定の軍事訓練活動から生じます。対照的に、高レベル爆風(HLB)曝露は、軍事戦闘、テロ攻撃、または大規模な偶発的爆発で一般的に遭遇する、強力で潜在的に破壊的な大きさの爆発力への曝露を伴います。したがって、LLB と HLB の主な違いは、爆発事象の強度、ひいては、身体的または機能的な損傷を経験する前に、被曝者が繰り返しの曝露に耐える能力にあります。この点で、HLB曝露の影響は、LLB曝露の影響よりも明白になる傾向があります。このため、LLBへの曝露が著しい人は、累積的な影響が認識できるようになるまで検出されないまま、ゆっくりと発症する怪我や欠損のリスクが高くなる可能性があります。

進行中の研究は、強度や反復などの爆風曝露の特性がどのように怪我を引き起こすかについての理解を深め、予防と医学的管理をより適切に導くことを目的としています。軍事医学では、爆風曝露の臨床的意味を理解することが最も重要であり、その結果、それらの結果を通知できる動物モデルが必要です。動物モデルはHLBの影響を解明するのに役立っていますが、LLB曝露の影響はほとんど研究されていません。数多くのモデリング研究により、10ポンド/平方インチ(psi)のピーク圧力1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15付近またはそれ以上の爆風過圧の影響が調査されています^。 16,17,18、しかし、いくつかのレポートは、1から7 psi 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31^の範囲の圧力レベルに焦点を当てています。 32,33,34,35,36は、軍事訓練環境37,38,39,40でより一般的であり、安全な環境曝露のための歴史的な閾値である4psi近くにあります。したがって、LLBの頻繁に使用されるピーク圧力の研究方法の広範な普及は、軍事医学および力の最適化への適用のための迅速な臨床的洞察を触媒するのに役立つ可能性があります。

LLB の職業上のリスクと多様な臨床診断との間に有意な関連性が、軍の LLB 41,42,43,44 の疫学調査から明らかになってきています。これらの研究は、用量依存性の関係が十分に定義されていないことを裏付けており、LLBへの反復的な曝露はリスクの増加を示しています⁴¹。このことは、累積爆風曝露の増加が、軍事現場での臨床転帰の形成に重要な役割を果たしていることを示唆しています。

10 psi未満のLLBに関する以前の動物モデリング研究では、主に爆発物またはショックチューブシステムを使用して、曝露の影響を調査してきました。これらのモデルは通常、1〜3回の曝露の影響を調べますが、それでも、メカニズム19,20,30,31、神経病理学的29,31,33、および行動的影響19,20,23,25,32,34の理解を深めることに貢献していますは、軍事訓練環境に典型的な低強度の爆風曝露に関連しています。

オープンフィールド爆薬によって生成された単一のLLBを調べた研究では、心的外傷後ストレスにしばしば関連する微妙な脳の病状と行動の変化の証拠が報告されています。Woodsら²⁴は、2.5-5.5psiで微細な脳損傷を検出できなかったが、質量分析によって脳組織のスフィンゴ糖脂質の量的変化を検出した。同じピーク圧力と実験デザインを用いて、Rubovitchら²⁵は、爆発後の行動変化を観察したが、これは光学顕微鏡で測定した場合、脳の病理が同様の欠如であった。しかし、その後の病理学的調査では、6.7psiのLLBばく露マウスの電子顕微鏡29,30,31,32,33によって、脳ミエリン、ミトコンドリア、ニューロン、および神経血管系に対する明確な超微細構造損傷が同定されました。興味深いことに、~10 psi以下の圧力のオープンフィールド爆薬を使用したいくつかのLLB研究では、1回の曝露後に約3〜8%の死亡率が報告されています^25,36。

同様の結果は、実験室のショックチューブを使用したいくつかの研究によって以前に注目されています。ショックチューブによって生成された単一のLLBを調べた研究では、神経細胞骨格の損傷と、単一の1.7psiブラスト²²への曝露後に発達したニューロン発火パターンの変化の証拠が見つかっています。4 psiでは、LLBに曝露されたラット²³の神経行動障害に伴う脳梁機能障害が報告されました。Chavkoら^は 、空気中で測定した爆風の持続時間と比較して、5.8psiに曝露したラットの脳では、爆風過圧の正相持続時間が有意に長いことを発見した。同様の損傷反応のバイオシグネチャーは、7.5psiのばく露後のマウスでの研究によって裏付けられる可能性があり、Ahmedら³⁵ は、ばく露後1か月以内に特定の炎症性、代謝性、血管、および神経損傷タンパク質の血清レベルに検出可能な変化を報告しています。興味深いことに、この研究では、ばく露後24時間で4.5%の死亡率も報告されました。

1回の20分間の曝露セッションで3つのショックチューブLLBを調べた研究では、1.4〜8.7 psiのLLBはラットの頭蓋内圧(ICP)のpsi依存的な上昇を引き起こし、観察可能なICPの変化はpsiが低いほど時間がかかり、認知変化をもたらしました^20,20。ブタを用いて、同じグループは、動物を人間の装備の使用をシミュレートする砲手の位置に置いたときに、さまざまな軍事装備からの3回の4psi LLB曝露が組織学的神経病理を引き起こすのに十分であると判断した²¹。

これらの研究は、限られた曝露と回復期間の条件下で発生する可能性のあるLLB曝露の多様な影響をまとめて示しています。反復的なLLB曝露は、持続的な認知障害および行動障害を誘発すると考えられており、それらの影響が臨床的に重要になる時期をより適切に判断できるように、累積的な影響を微妙に理解する必要性を強調しています。これは、高レベルの反復LLBにさらされている軍事訓練生に特に関連します。これを達成するためには、現在の文献が数日間で1回から数回の爆風を超える日常的な軍事訓練被曝の臨床経験を適切にモデル化していないため、新しい研究が必要である。

特殊作戦部隊 (SOF) は、日常的な曝露中に、重大で非常に反復的な LLB に耐える可能性があります。最近の研究では、爆発的なエントリーブリーチングチームのすべてのポジションで匿名化された代表的な曝露は、1週間のトレーニング⁴²の過程で184の累積ピークpsiと推定されています。これは、部分的には、1日あたり6回の違反電荷が使用され、人員に取り付けられた爆風計で測定された平均4psiのピーク圧力という控えめな見積もりに基づいています。フラッシュバンやその他のデバイスは考慮されていません⁴⁵。定期的なトレーニングサイクルは数週間続く場合があります。トレーニングSOFメンバーの経験など、臨床LLB経験の研究を容易にするために、非常に反復的なLLB曝露の実験室ショックチューブモデルを提示します。この方法は、確立された空気圧ショックチューブシステム46,47,48に基づいており、2psi以上の圧力の再現性の高い調査を可能にします。この手順は、天候などの外部要因に依存せず、死亡が観察されず、ラボベースです。その結果、この手法により、数週間から数か月にわたる研究のために、同じ被験者で毎日持続的に反復的なLLB曝露が可能になり、軍事訓練の忠実度の高い調査が容易になります。

プロトコル

すべての手続きは、退役軍人省ピュージェットサウンドヘルスケアシステム施設用動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコル#1588223に基づいて、および実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所ガイドに従って行われました。

1. アニマルケア

注:LLBの動物モデルは、その入手可能性とサイズに対応するためのショックチューブの容量によってのみ制限されます。本明細書に記載のショックチューブは、マウスで使用するために特別に設計されました。

1. 実験的なニーズに応じて、生後3〜4ヶ月の雄または雌のC57BL / 6Jマウスまたはその他の承認されたマウス系統を使用してください。マウスを特定の病原体のない施設で12時間の暗光サイクルに維持し、食物と水に 自由 にアクセスできます。マウスは通常、ケージに4匹または5匹と一緒に社会的に飼育されています。施設の温度を20〜22°Cに保ちます。
2. ブラストマウスと偽マウスが入ったケージを近くの待機エリアに持って行きます。ブラストルームとの間で個々のマウスを移すために、別々の空のケージを持参してください。

2. ショックチューブの準備

1. (安否確認) 特定のシステムに必要な安全性チェックが完了していることを確認します。ガス供給(ヘリウム)とマスター電源がオフになっている/切断されていることを確認してください。
2. 必要に応じて、特定の数の低強度ブラストを行うために膜を準備します(図1.1)。このプロトコルで使用される特定のショックチューブの必要に応じて、メンブレンの寸法をカットします。
   1. プラスチック製のラップを1枚5.5インチ x 5.5インチの正方形にカットしてスプールを密封し、加圧します。
   2. 標準の8.5 "x 11"コピー用紙(75 g / m² 重量)の1枚を5.5 "x 11"にカットします。出来上がった紙を半分に折り、5.5 "x5.5"の正方形を形成します。
   3. 500 Gのマイラーメンブレン(厚さ125 μm)を1枚入手します。
      注:これらのシートは、標準的な低強度ブラストによって破裂したり、大幅に変形したりすることはなく、1日の処置期間中は再利用できます。
3. 四角いラップと折りたたまれた紙の正方形を取り、平らな面に置きます(図1.2)。折りたたんだ紙をラップの上に置き、2つをできるだけ一致させます(図1.3)。反復的なブラストを迅速化するために、ここですべてのメンブレンスタックを配置します。
4. ドライバーとスプールの間にマイラーメンブレンを巻き上げて小さなチューブ(人差し指と同じくらいの大きさ)に挿入します。 図1.4、1.5)。それをメカニズムに完全に挿入し、ドライバーセクションをスプールから分離するゴム製シールに対して展開できるように離します。スプールをドライバーに向かって押して、マイラーシートを所定の位置に固定します。これにより、ショックチューブの駆動部分からスプールが外れます。
5. 指をラップの上半分の下に置き、ラップと紙の両方を慎重に手前に転がし、位置がずれないように一緒に丸めるようにします(図1.6)。
6. スプールとショックチューブの被駆動部分の間にメンブレンスタックを挿入します(図1.7)。
7. プラスチックシールがスプールに向けられ、用紙がチューブの被駆動部に向くように、メンブレンスタックを広げます(図1.8)。
   注意: この向きにより、システムを加圧できるように気密シールが作成されます。
8. スプールアセンブリを閉じます(図1.9、1.10)。必要に応じて、ボルトを手または油圧で締め、ドライバー-スプール-ショックチューブアセンブリを固定して、システムを加圧できるようにします。(安全チェック;図1.10)
   注:油圧システムの場合、クロージャーアセンブリの目標圧力に達していることを確認して、メンブレンの交換が必要になり、LLB曝露プロセスが遅くなる可能性のある失火を防ぎます。油圧を使用して、500psiでアセンブリを閉じます。

3.動物の調理

1. 温度を37°Cに設定して、麻酔チャンバーの下にある循環水加熱パッドをオンにします(図1.11)。ヒートパッドの上に吸収性医療パッドを置きます。
2. 待合室で、1匹のマウスをホームケージから取り出し、空のトランスファーケージに入れます。ケージに入れられたネズミをブラストルームに持ってきます。
3. 酸素流量を1.0 L / min(lpm)に回し、真空スカベンジシステムをオンにします(図1.12)。
4. イソフルランを5%にオンにし(急速な意識喪失を誘発するため)、流れをげっ歯類の麻酔室にルーティングします(図1.13)。
5. マウスをチャンバーに入れて麻酔を誘発します(図1.14)。
6. マウスが完全に麻酔され、さらに 30 秒間安定した呼吸を示したら、チャンバーに手を伸ばしてマウスを耳にパンチし、残りの研究を通じてマウスを明確に長期的に識別します。この手順を今すぐ行うことは、爆発後の回復時間を妨げないようにするために必要です。その後、角膜の乾燥を防ぐために、滅菌済みの眼科用潤滑剤を両眼に塗布します。
7. マウスをチャンバーから取り外し、その鼻をノーズコーンに入れます(図1.15)。麻酔の流れ(イソフルランなど)を誘導室からノーズコーンに切り替えます。
8. 実験用テープの小片を使用して、マウスの手足を担架に軽く拘束します(図1.16)。
9. マウスを拘束した後、各肢にワイヤーツイストタイを付け、しっかりとねじり、マウスを手首と足首の担架に固定します(図1.17)。胸の周りに大きなツイストタイを置き、マウスの呼吸が制限されないように非常に緩く結びます。これは、手足の拘束具が緩んだ場合の二次的な拘束メカニズムとして機能します。
10. マウスのテールを持ち上げて左足の下に置き、ガーニーをショックチューブに挿入したときにマウスが挟まれないようにします(図1.18)。

4. LLB手続き

1. ショックチューブの動物への露出部分を開き、マウスが迫り来る爆風に面するようにマウスを向けます(図1.19)。
2. 動物暴露セクションの担架を固定/吊り下げます(図1.20)。
3. 動物暴露セクションのドアをしっかりと閉め、麻酔薬の流れチューブがドアに挟まれないようにします(図1.21)。
4. 麻酔を 2.5-3% イソフルラン、セッションの残りの部分で 1 lpm に減らします。
5. 必要に応じてシステムの電源を入れます(図1.22)。
6. 圧縮ヘリウムガスの供給ラインを見つけて接続します(図1.23、1.24)。
7. ブラストルームを出て、隣接するルームのブラストチューブコントロールコンソールにアクセスし、ブラストルームに人員や動物が残っていないことを確認します。
   注:聴覚保護は、機関または運用条件によって必要になる場合があります。このような条件には、制御コンソールがショックチューブと同じオープンスペースに配置されているショックチューブの配置が含まれる場合があります。
8. コンソールから、爆破イベントを記録するための集録ソフトウェアをオンにします( 図1.25の緑色のボックスを参照)。
   注:これらの手順では、20キロヘルツ(kHz)のサンプリングレートでセンサーデータを収集し、LabViewソフトウェアを使用して処理します。≥10 kHzでセンサー・サンプリングを取込むことで、高品質の時間対圧力曲線を実現することをお勧めします。
9. 安全ロック( 図1.26の緑色の矢印で示されている電源制御キーなど)をすべて解除します。
10. 両方のガスベントを閉じ、スプールを受動的に加圧します(図1.27)。ドライバー側は使用しないでください。メンブレンが、使用するメンブレンシートの数によって決定される目標ピークpsiで自力で破裂するまで充填を続けます。
11. 動物の位置でのピーク圧力、正相の持続時間、およびインパルスを記録します。(図1.28)。塗りつぶしメカニズムをオフにします。
12. ショックチューブに戻り、ヘリウム供給ラインを切断し、ブラスト制御回路への電源を切ります(図1.29)。
13. 同じ動物でLLB曝露を繰り返し行うには、スプールを開き、スプールメンブレンスタックを取り外してから、別のスプールメンブレンスタックをロールして挿入します(図1.30、1.31、1.32)。メンブレンスタックを平らにし、アセンブリを再度閉じます。
    注:経験的に定義されたSOFトレーニング中の低レベルの爆風曝露の臨床経験をモデル化するために、マウスを1日あたり5〜6 LLBsに曝露し、毎日の曝露を保守的な~20累積合計psi⁴⁵に制限します。メカニズムと用量反応の関係を強調する研究では、セッションごとに定義された過圧パラメータで一貫した数のLLB曝露を使用することを選択することもできます。
14. 現在の動物の最終的なLLBの後、麻酔をかけたままショックチューブから取り外します(図1.33)。
15. 麻酔下にある間に動物をほどきます。麻酔ノーズコーンから取り外し、仰向けにして温水パッドに置きます(図1.34)。
16. 動物をウォーターパッドに置いたら、タイマーを開始し、マウスが腹側(つまり、胃)にひっくり返るまでの時間を記録します(図1.35)。この時間を正しい時間として記録します。マウスが回復したら、ホームケージに戻し、必要に応じてモニタリングを続けます。

5. 複数日の手続き

1. SOF近接戦闘訓練中に使用される違反電荷からの日常的なLLB曝露をモデル化するには、マウスに対して週5日(月曜日から金曜日)に毎日繰り返し曝露を行い、3つの標準作業週にわたって合計15日間曝露します。

6. ピークLLB圧力の変更

1. より強力なメンブレン材料を使用するか、追加のメンブレンを積み重ねるだけで、ピーク圧力を上げます。たとえば、マイラー ロール クリア 0.005 (500 G) メンブレンを使用して ~20 psi のピーク圧力を生成するか (ドライバー メンブレンとスプール メンブレンの両方として使用する場合)、マイラー ロール クリア 0.002 (200 G) メンブレンを使用して ~10 psi のピーク圧力を生成します。
2. 実験のニーズに合わせて、爆風の正の位相、持続時間、およびインパルスのパラメータを調整します。正の位相の持続時間とインパルスを調整するには、圧縮ガス源^47、49 を代入するか、可能な限りドライバーの長さを変更することにより、目標条件を経験的に決定する。上記のプロトコルは、ヘリウムを使用して、理想的なフリードランダー曲線に似た鋭いピーク圧力と波形を作成します。

7. ティッシュコレクション

注:組織採取の方法は、実験のニーズに応じて調整することができます。

1. 210 mg / kgのペントバルビタールによる腹腔内注射によりマウスに麻酔をかけます。
2. マウスをバーまたは既製のメッシュを備えたマウスまたはラットケージに入れます。ケージに入れられたマウスをドラフトに入れます。
3. マウスが反応しなくなったら、ケージ上部のバーにマウスを仰向けに置き、バーの1つの周りで口を閉じて、灌流中にマウスが所定の位置に留まるようにします。
4. 胃の皮膚をつかんで上に引っ張り、臓器を切らないように注意しながら、大きなハサミで腹腔内に穴を開けます。リブの基部に沿ってさらに切り込み続けて、リブケージのより自由な関節を可能にします。
5. 止血器を使用して、マウスに横から近づき、胸郭の真上で組織をつかみ、止血器を後ろに転がして、胸郭の基部が簡単にアクセスできる位置に角度をつけます。一対の鉗子または同様のツールを使用して、止血剤を所定の位置に保持します。
6. 小さな手術用ハサミを使用して、横隔膜を慎重に切断し、心臓にアクセスできるようにします。一対の鉗子を使用して、底が胸郭の開いた基部から直接出るように心臓をゆっくりと傾けます。灌流中も心臓が鼓動し続けるように、素早く作業します。
7. 採血する場合は、一対の鉗子で心臓を保持し、先端に0.5インチ25Gの針が付いた3mLの注射器を使用して右心室を慎重に突き刺します。心室の底から挿入し、心室の反対側を突き刺さないように注意しながら、縦方向に入れます。0.5〜1.0 mLの血液が採取されるか流れが止まるまでシリンジをそっと引っ張ってから、シリンジを取り外します。.
8. 外科用ハサミを使用して、右心房の小さな切開部を切開し、血液と灌流液を排出します。一対の鉗子で心臓を保持し、25Gの蝶針を左下から挿入して左心室に慎重に挿入します。保持clで蝶針を所定の位置に保持しますamp または手で。
9. 動物を灌流します。
   1. 50 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含むシリンジをバタフライニードルに接続し、約10 mL /分の速度で灌流します。.適切な灌流の兆候として肝臓のブランチングを探します。シリンジが空になったら、バタフライニードルから外します。
   2. 顕微鏡検査用の組織を調製する場合は、空のPBSシリンジを、50 mLの10%中性緩衝ホルマリン(NBF)または4%ホルムアルデヒド溶液を含むシリンジと交換します。上記の手順を繰り返して、ホルマリンで灌流します。
      注:灌流されたマウスは、灌流中にけいれんすることが観察されるべきです。これにより、手順が完了した後に全身の厳しさまたは硬直が生じるはずです。
10. 心臓から蝶の針を取り外し、組織収集のためにケージバーからマウスを取り出します。
11. 必要に応じて、標的臓器を取り外して細分化します。新鮮な固定されていない材料が収集されている場合は、氷上で手順を実行するよう注意してください。
12. 液体窒素に採取した未固定組織を急速凍結し、タンパク質またはRNAターゲットをアッセイするプロトコルで使用するまで-80°Cで保存します。
13. 固定組織の場合は、ホルマリンで満たされたラベル付きの50 mLコニカルチューブ(臓器ごとに1本のチューブ)に移します。.

ディスカッション

私たちは、理解が不十分なものを適切に治療することができず、非常に反復的なLLB曝露に関連する損傷メカニズムをまだ理解していません。多くの特殊作戦部隊要員は、運用サービスの5年から10年以内に非常に反復的なLLB曝露に関連していると考えられている健康関連障害の発症を報告しています^50,51。一部の特殊作戦部隊要員は、LLB曝露の直後に急性外傷性脳損傷(TBI)のような神経認知的影響を発症する³⁹。さらに、臨床医は、爆風曝露に起因する症状はしばしば従来の治療に難治性であると報告しており、それが特殊作戦部隊と臨床医が代替治療に目を向けるよう駆り立てる可能性がある^52,53。SOFのLLBへの頻繁な曝露と過圧メカニズム⁴⁵、結果として生じる症状の重症度と治療抵抗性、および爆風関連の星状膠細胞瘢痕⁵¹の文書化されたパターンにもかかわらず、長期的な健康上の結果は比較的不明のままです。臨床医や軍の指導者は、損傷のメカニズムや病態生理学を明らかにするために、モデリング研究に依存しています。これらのモデルは、病理プロセスを早期に特定、中断、予防、および治療するためのポリシーと戦略を開発するために重要です。

重要なことに、一般的な軍用LLB曝露のマウスモデリングは、健康予測モデルに情報を提供することが期待されています。臨床診療は、いもち病関連の病理学のリスクが最も高い人、どのいもちの特性が最も深刻な結果を引き起こすか、およびいちょう風曝露の慢性性、投与量、または特異性に基づいて疾患プロセスがどのように進行するかを特定するLLB予測モデルの恩恵を受けるでしょう。したがって、反復的なLLB曝露をモデル化することは、曝露が特殊部隊や他の軍人の健康転帰にどのように影響するかについての仮説と予測を開発するために不可欠です。予測モデルと傷害メカニズムモデルは、診断と治療、および症状と曝露に基づく職務復帰の決定に情報を提供します。

マウスにおける芽球誘発性TBI(bTBI)の研究は、近年、特にヒトにおける慢性反復性軽度のbTBI後の転帰を予測するモデルの開発により、大幅な進歩が見られました^54,55。ショックチューブを使用した中高レベルの爆風曝露の研究は、何百ものPubMedインデックス記事^46,56,57,58で十分に開発されていますが、日常的な軍事訓練の過圧(<6 psiピーク圧力⁴⁰)の近くの爆風の研究でのショックチューブの使用はあまり発展しておらず、最近のPubMed検索で確認された記事は10未満です^{19,20。22、23、26、27、28}。この研究が進んでいない分野の発展を促進するために、提示されたモデルは、マウスの一貫したLLB過圧、爆破後の回復、およびモニタリングの主要な考慮事項に焦点を当てるとともに、オープンフィールド爆薬の使用に対するこのモデルのいくつかの明確な利点に注目しています。実際、記載されている実験室のLLBモデルは、慢性反復LLB後の臨床転帰の予測モデルの開発を可能にする可能性があると主張しています。

LLBモデルは、特に動物福祉の観点から、オープンフィールド爆薬モデルに比べて重要な利点を提供します。オープンフィールドモデルでは、3〜8%の死亡率^25,36をもたらす可能性がありますが、このラボベースのLLBモデルでは損失は示されていません。この区別は、特に軍事訓練に典型的な高い累積曝露をシミュレートする場合に重要であり、LLB曝露による致命的な結果を経験する訓練生はほとんどいません。無呼吸症候群や致死性肺外傷などの他の死因が明らかに存在しないため、モデルの信頼性と一貫性が確保され、反復性LLBの臨床的に関連する影響に関する研究に適した選択肢として位置付けられています。

このプロトコルは、ドライバー、スプール、および駆動セクションで構成される3つの部分からなる設計の「オープンエンド」ショックチューブに特有のものです。非常に反復的なLLBは、プロトコルに適切な変更を加えることで、他のショックチューブ設計で達成できる場合があります。オープンエンドのショックチューブ設計は、爆風誘発性神経外傷の研究に頻繁に使用されます46,47,48。オープンエンドの衝撃管は、出口端が開いていることを特徴とするため、生成された衝撃波は、チューブの反対側の端を出る前に、ターゲット(例えば、動物の被験者)に遭遇するチューブの長さに沿って自由に伝播することができます。この設計は、比較的純粋な一次爆風過圧の再現と研究を容易にし、露地⁴⁸で発生する爆風爆発の特性に近似する。その結果、経験的に測定された爆風過圧波の忠実度が、理想化されたフリードランダー波と比較されます。これにより、チューブの性能を評価して、特定の過圧イベントを生成できます。LLB曝露をモデル化するために、我々は、もともと~25フィートのスタンドオフ距離で200+ポンド以上のトリニトロトルエン(TNT)のHLB爆発の影響を再現するために設計された^{、前述の48}のカスタムビルドのオープンエンドブラストチューブを使用します。高いピーク過圧を可能にするために、ガスがドライバーに加圧され、メンブレンによってスプールから分離され、ドライバー内のガスが密閉されます。次に、スプールもまた、別の膜によってオープンエンドセクションから分離されています。この第2の膜により、スプールを別々に加圧することができます。デュアルチャンバーシステムにより、ドライバー内のガスを膜の通常の破裂点を超えて加圧することができます。これは、加圧されたスプールが緩衝材として機能し、ドライバーとスプールの界面でメンブレンを支え、破裂を防ぐために発生します。ショックチューブのオペレーターが目標圧力で衝撃波を発生させたい場合、電子バルブがスプールからガスを排出し、スプール内の圧力を急速に低下させ、ドライバーセクションの過圧ガスがドライバーとスプール膜の両方を破裂させ、ターゲットゾーンで動物に遭遇するチューブの長さまで急速に拡大します。この設計の高性能チューブでのLLBの研究を可能にする主な変更は、ドライバーをブロックオフし、スプールを低しきい値メンブレンと組み合わせてのみ使用することです。

LLB実験の信頼性と再現性を確保するには、セットアップ中に特定のアクションを実行する必要があります。腕と脚を手首と足首でしっかりと固定することが重要です。これにより、身体の動きや爆風への曝露のばらつきが最小限に抑えられ、結果を混乱させる可能性のある意図しない怪我を防ぐことができます。さらに、手首と足首を内側に回転させると、付属肢の動きを動物の正中線に向けるのに役立ち、その後の運動能力評価に影響を与える可能性のある遠位損傷のリスクが軽減されます。頭と脊椎の湾曲の矯正は、可動域の潜在的な違いを減らすのに役立つため、被験者間で均一な爆風曝露を確保するためのもう1つの重要な要素です。麻酔に使用されるイソフルランの割合を増やすことは、数日または数週間にわたるプロトコルに推奨されます。この調整により、長時間の実験期間中、麻酔の深さを一定に保つことができます。私たちの経験では、0.5%のイソフルランの増加は、適切な麻酔を維持するのに十分です。

ただし、ノーズコーンを介した麻酔送達は、すべてのブラストチューブ設計、特にチューブを駆動部に挿入できない完全なエンクロージャーを持つ設計では不可能な場合があります。このような場合、注射可能な麻酔薬が好ましい場合があります。.繰り返される連続したブラストの送達に必要な時間を決定し、手順全体で意識を失うのに十分な麻酔薬を投与することをお勧めします。この改良された方法の開発中に、適切な麻酔の維持を確保するために、追加の動物福祉チェックが必要になる場合があります。さらに、注射剤の使用により、是正時間測定値の収集などの急性期後の反応モニタリングが不可能になる可能性があります。

動物研究では倫理的配慮が最も重要であり、このラボベースのLLBモデルには、包括的なブラスト後の回収およびモニタリングプロトコルが組み込まれています。呼吸困難、立ち直れない、2時間の観察期間後の非歩行状態、発作のような動き、ぎこちない動き、視力障害、および内出血または手足の骨折の証拠を含む、爆風曝露後の人道的なエンドポイントが綿密に観察されます。特に、LLB芽球マウスは、私たちの実験ではこれらの条件を全く示しませんでした。ただし、HLB中に四肢の骨折が発生する可能性があり、多くの場合、オペレーターのエラーが原因です。このリスクを軽減するには、ガーニーの固定中に手と足を動物の正中線に向かって回転させることが必要です。この手法は、爆風が付属肢を後方に吹き飛ばし、関連する骨を壊すのを防ぎます。

この反復的なLLBモデルの利点は、倫理的な考慮事項を超えて、実践的および方法論的な側面にまで及びます。ラボベースの設計により、爆発物の取り扱いが不要になり、安全性とアクセス性が向上します。このモデルは再現性が高く、カスタマイズ可能であるため、研究者はさまざまなガスタイプ、デバイス設定、および膜強度を使用して曝露パラメータに影響を与えることができます。ヘリウムは、オープンフィールドの爆発速度⁴⁹を再現する能力のためにここで選択されており、信頼性の高いベースライン47,59,60を提供する可能性がある。ピーク圧力の調整は、保持膜の厚さまたは強度を変更することで経験的に達成され、特定の実験要件に合わせて微調整できます。最後に、LLBモデルは、季節や天候の変動がデータ、動物への曝露、およびその他の実験的要因に与える影響を排除します。この一貫性により、堅牢で信頼性の高い結果が得られ、この反復LLBモデルは、縦断的および高度に反復的なブラスト研究にとって非常に貴重なツールとなります。

爆風関連の神経外傷を理解するには、損傷のメカニズム、爆風強度の指標、および閾値を解明する必要があります。しかし、爆風シナリオにおけるヒトの脳損傷メカニズムには不確実性がつきまとっています。爆風被曝後の人的被害の基準は動物実験に依存していましたが、種⁶¹全体のスケーリング基準が不完全であるため、これらの研究を人間に直接適用することは困難です。動物の体重に基づく肺損傷のスケーリングは、受け入れられた基準^62,63 の存在を考えると、例外です。しかし、身体^64,65または脳質量⁶⁶に基づく脳効果のスケーリング法則は、特に脳の内部および周囲の保護構造に関する既知および未知の解剖学的違いを見落としている。マススケーリングは、体が小さい種でより高い傷害リスクを予測しますが、これは鳥67,68,69とヒト⁷⁰の両方の研究と矛盾しています。したがって、正確なスケーリング法則を開発するには、種間の外部爆風イベントの強度と内部脳への影響との関係を経験的に理解する必要があります。LLBの場合、動物モデルまたはヒトにおける単回または慢性の曝露についてはほとんど知られていません。その結果、LLB強度範囲での将来のスケーリング法則の開発に情報を提供するために必要な実証研究は、私たちの方法によって触媒される可能性があります。

要約すると、この実験室ベースのショックチューブモデルは、マウスのLLB曝露の慢性的な影響の研究における大幅な進歩を表しています。このラボベースのLLBモデルは、一貫した過圧をモデル化するための手順を組み込み、ブラスト後の回復とモニタリングを優先し、代替モデルに対する明確な利点を強調することにより、慢性LLB曝露に関連する損傷の理解を深めるための信頼できる倫理的な選択肢を提供する可能性があります。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adroit Thermal Recirculating Heat Pump (120 V)	Parkland Scientific	HTP-1500
Copy paper, 75 g/m2 weight	Staples	897804
Disposable Absorbant Blue Pads	VWR	82020-845
Forane Inhalant Solution	MedLine	10019-360-60
Helium	Linde	UN1046
Laboratory tape (1")	VWR	89098-076
LabView software	Emerson	V 2011
Medical oxygen	Central Welding Supply	UN1072
Mylar, 0.005 thickness	Tapp Plastics	22934
Plastic cling wrap	Santa Cruz Biotechnology	sc-3687
Plastic twist ties	VWR	11215-940
Pneumatic Shocktube (with driver and spool sections; target area sized for mice, 20 kHz sampling rate pressure sensors, control and acquisition software)	BakerRisk, San Antonio, TX	custom
Reusable Heavy Duty Heating Pad (12" x 18")	Parkland Scientific	121218
Scissor-style, Rodent Ear Punch	Kent Scientific	INS750076-2
Sliding Top Chambers for Traditional Vaporizers	Kent Scientific	VetFlo-0530SM
VetFlo Isoflurane Vaporizer	Kent Scientific	VetFlo-1210S