对小鼠高度重复的低水平爆炸暴露进行建模

摘要

这里介绍的是利用小鼠产生重复低强度爆炸曝光的方法。

摘要

暴露于爆炸物是暴露者脑外伤的重要危险因素。尽管大型爆炸对大脑的影响已广为人知，但较小爆炸（例如在军事训练期间发生的爆炸）的影响却鲜为人知。这种小的、低级别的爆炸暴露也根据军事职业和训练节奏而有很大差异，一些单位在几年内经历很少的暴露，而另一些单位在几周内经历数百次。动物模型是确定低水平爆炸暴露后的损伤机制和长期临床健康风险的重要工具。能够概括这种广泛暴露的模型对于在这些不同的风险状况中告知急性和慢性损伤结果是必要的。

尽管很容易对几次低水平爆炸暴露后的结果进行建模以进行机制研究，但职业生涯中发生的慢性暴露可能通过爆炸损伤范式更好地建模，这些爆炸损伤范式在数周和数月内频繁发生重复暴露。这里显示的是模拟小鼠高度重复的低水平爆炸暴露的方法。这些程序基于已建立且广泛使用的空场爆炸暴露的气动冲击管模型，可以缩放以调整超压参数以及暴露的次数或间隔。然后，这些方法可用于进行机制研究或概括所研究临床组的常规快速爆炸暴露。

引言

当个人或建筑物受到相对较低强度的爆炸力时，就会发生低水平爆炸 （LLB） 暴露，这通常是由小型工业事故、受控拆除或某些军事训练活动引起的。相比之下，高级别爆炸 （HLB） 暴露需要暴露于强烈且具有潜在破坏性的爆炸力，这在军事战斗、恐怖袭击或大规模意外爆炸中很常见。因此，LLB 和 HLB 之间的主要区别在于爆炸事件的强度，以及引申开来，暴露人员在遭受身体或功能伤害之前忍受反复暴露的能力。在这方面，HLB 暴露的影响往往比 LLB 暴露的影响更明显。正因为如此，大量接触 LLB 的人可能更容易发生缓慢发生的伤害或缺陷，这些损伤或缺陷在它们的累积影响变得明显之前不会被发现。

正在进行的研究旨在增强我们对爆炸暴露特性（例如强度或重复性）如何导致伤害的理解，以便我们更好地指导预防和医疗管理。在军事医学中，了解爆炸暴露的临床意义至关重要，因此，需要能够告知这些结果的动物模型。尽管动物模型有助于阐明 HLB 的影响，但 LLB 暴露的影响在很大程度上仍未得到充分研究。许多建模研究检查了接近或高于 10 磅/平方英寸 （psi） 峰值压力 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15^， 16,17,18，但很少有报告关注 1 到 7 psi 的压力水平 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31^， 32,33,34,35,36，这在军事训练环境中更为常见 37,38,39,40，并且接近 4 psi 的历史阈值，以实现安全环境暴露。因此，更广泛地传播 LLB 常用峰值压力研究方法可能有助于促进快速临床见解，以应用于军事医学和力量优化。

从军事 LLB 的流行病学调查中可以看出 LLB 的职业风险与各种临床诊断之间的显着关联 41,42,43,44。这些研究支持定义不明确的剂量依赖性关系，重复的 LLB 暴露表明风险增加⁴¹。这表明，增加累积爆炸暴露在塑造军事环境中的临床结果方面起着至关重要的作用。

以前对 10 psi 以下的 LLB 进行的动物建模研究主要使用炸药或减震管系统来研究暴露的影响。尽管这些模型通常检查一到三次暴露的影响，但它们仍然有助于加深对机制 19,20,30,31^、神经病理学 29,31,33 和行为后果 19,20,23,25,32,34 的理解，与军事训练环境中典型的低强度爆炸暴露有关。

检查由开场炸药产生的单个 LLB 的研究报告了细微的脑部病变和行为变化的证据，这些变化通常与创伤后压力有关。Woods 及其同事²⁴ 无法在 2.5-5.5 psi 下检测到微观脑损伤，但他们确实通过质谱法检测到了脑组织鞘糖脂的定量变化。使用相同的峰值压力和实验设计，Rubovitch 及其同事²⁵ 观察到了爆炸后的行为变化，当通过光学显微镜测量时，这些爆炸发生在类似的缺乏脑部病变的情况下。然而，在随后的病理学研究中，通过电子显微镜 29,30,31,32,33 在 6.7 psi LLB 暴露的小鼠中确定了对脑髓鞘、线粒体、神经元和神经血管系统的明确超微结构损伤。有趣的是，几项使用压力为 ~10 psi 及以下的开场炸药的 LLB 研究报告称，单次暴露后死亡率约为 3-8%^25,36。

之前使用实验室减震管的几项研究也注意到了类似的结果。在检查电击管产生的单个 LLB 的研究中，已经发现了暴露于单次 1.7 psi 爆炸后神经细胞骨架损伤和神经元放电模式变化的证据²²。据报道，在 4 psi 时，胼胝体功能障碍伴随着 LLB 暴露大鼠的神经行为缺陷²³。与在空气中测量的爆炸持续时间相比，Chavko 及其同事²⁷ 发现，在暴露于 5.8 psi 的大鼠大脑中，爆炸超压的正相持续时间明显更长。一项在 7.5 psi 暴露后对小鼠进行的研究可能支持类似损伤反应的生物特征，其中 Ahmed 及其同事³⁵ 报告了在暴露后长达一个月内血清中特定炎症、代谢、血管和神经损伤蛋白水平的可检测变化。有趣的是，这项研究还报告了暴露后 4.5 小时的死亡率为 24%。

在单次 20 分钟暴露过程中检查三个冲击管 LLB 的研究中，1.4 到 8.7 psi 之间的 LLB 会导致大鼠颅内压 （ICP） 的 psi 依赖性增加，可观察到的 ICP 变化需要更长的时间才能降低^{psi 20}，并导致认知变化^19,20。使用猪，同一小组确定，当动物被放置在模拟人类使用设备的炮手位置时，来自各种军事设备的 3 次 4 psi LLB 暴露足以引起组织神经病理学²¹。

这些研究共同说明了在有限暴露和恢复期的条件下可能发生的 LLB 暴露的不同影响。重复的 LLB 暴露似乎会导致持续的认知和行为缺陷，强调需要对累积效应进行细致的了解，以便我们能够更好地确定这些影响何时可能变得具有临床意义;这对于暴露于高水平重复 LLB 的军事实习生尤其相关。为了实现这一目标，需要新的研究，因为目前的文献没有充分模拟在几天内超过一到几次爆炸的常规军事训练暴露的临床经验。

特种作战部队 （SOF） 在常规暴露期间可能会遭受严重且高度重复的 LLB。最近的一项研究估计，在爆炸物进入突破团队中，所有位置的匿名代表性暴露量在一周的训练过程中高达 184 累积峰值^{psi 42}。这在一定程度上是基于每天使用 6 次违规装药的保守估计，每次平均峰值压力为 4 psi，由人员安装的爆破计测量;它不考虑闪光弹和其他设备⁴⁵。常规训练周期可能持续数周。为了促进临床 LLB 经验的研究，例如培训 SOF 成员的经验，我们提出了一个高度重复的 LLB 暴露的实验室冲击管模型。该方法基于已建立的气动减震管系统 46,47,48，允许对 2 psi 及更高的压力进行高度可重现的研究。该程序不依赖于天气等外部因素，不会观察到死亡率，并且是基于实验室的。因此，该方法可以在持续数周到数月的研究中对同一受试者进行持续的、每天重复的 LLB 暴露，从而促进对军事训练的高保真调查。

研究方案

所有程序均根据协议 #1588223 进行，该协议由退伍军人事务部普吉特海湾医疗保健系统机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南。

1. 动物护理

注意：LLB 的动物模型仅受其可用性和减震管容量的限制，以适应其大小。此处描述的休克管是专门为小鼠设计的。

1. 根据实验需要，使用 3-4 个月大的雄性或雌性 C57BL/6J 小鼠或其他经批准的小鼠品系/品系。将小鼠维持在特定的无病原体设施中 12 小时的暗光循环中，可 随意 获取食物和水。小鼠通常被关在一个笼子里，有 4 或 5 只。将设施温度保持在 20-22 °C。
2. 将装有 Mlast 和 Sam 老鼠的笼子带到附近的饲养区。带上单独的空笼子，以便将单只小鼠转移到鼓炎室或从喷砂室转移。

2. 减震管准备

1. （安全检查） 确认已完成特定系统的必要安全检查。确保气源（氦气）和主电源已关闭/断开。
2. 根据需要准备膜，以进行特定数量的低强度喷射（图 1.1）。根据本协议中使用的特定减震管的要求切割膜尺寸：
   1. 将一张塑料保鲜膜切成 5.5 英寸 x 5.5 英寸的正方形以密封线轴，使其加压。
   2. 将一张标准 8.5 英寸 x 11 英寸复印纸（75 克/米² 重量）切割成 5.5 英寸 x 11 英寸;将生成的纸张对折，形成一个 5.5 英寸 x 5.5 英寸的正方形。
   3. 获得一张 500 G 聚酯薄膜（125 μm 厚度）。
      注意：这些片材不会因标准低强度喷砂而破裂或明显变形，并且可以在一天的手术期间重复使用。
3. 取一块正方形的保鲜膜和一块折叠的纸，将它们放在平坦的表面上（图 1.2）。将折叠好的纸放在保鲜膜的顶部，并尽可能将两者对齐（图 1.3）。为了加快重复的爆炸速度，现在就安排好所有的膜堆栈。
4. 将聚酯薄膜卷成一根小管（大约与食指一样大;图 1.4,1.5）。将其完全插入机构中，然后松开以使其在将驱动器部分与线轴分开的橡胶密封件上展开。将线轴推向驱动器以将聚酯薄膜片固定到位;这将从减震管的驱动部分解封线轴。
5. 将手指放在保鲜膜的上半部分下方，小心地将保鲜膜和纸张朝您的方向滚动，确保它们一起卷起而不会错位（图 1.6）。
6. 将膜组插入线轴和减震管的驱动部分之间（图 1.7）。
7. 让膜叠展开，使塑料密封件朝向线轴，而纸张朝向管的驱动部分（图 1.8）。
   注意：此方向将形成气密密封，以便系统可以加压。
8. 关闭线轴组件（图 1.9、1.10）。根据需要，用手或液压拧紧螺栓，固定驾驶员滑阀芯减震管组件，以便系统可以加压。（安全检查;图 1.10）
   注意：对于液压系统，请确保达到瓶盖组件的目标压力，以防止失火，这可能需要更换膜并减慢 LLB 暴露过程。我们使用液压系统在 500 psi 的压力下关闭我们的组件。

3. 动物准备

1. 打开麻醉室下方的循环水加热垫，温度设置为 37 °C（图 1.11）。在加热垫顶部放置一个吸水医用垫。
2. 在拘留室中，从其家笼中取出一只鼠标，并将其放入空的转移笼中。将笼中老鼠带入喷砂室。
3. 将氧气流速调至 1.0 L/min （lpm） 并打开真空扫气系统（图 1.12）。
4. 将异氟醚调至 5%（以诱导快速失去知觉）并将流量引导至啮齿动物麻醉室（图 1.13）。
5. 将鼠标放入腔室中以诱导麻醉（图 1.14）。
6. 一旦小鼠完全麻醉并表现出稳定的呼吸 30 秒，伸手进入腔室并敲击鼠标，以便在研究的剩余时间内明确地长期识别小鼠。现在执行此步骤是必要的，以避免干扰爆炸后的恢复时间。然后，将无菌眼用润滑剂涂抹在双眼上，以防止角膜干燥。
7. 从腔室中取出鼠标，将其鼻子放入鼻锥中（图 1.15）。将麻醉液（例如异氟醚）从诱导室切换到鼻锥。
8. 使用小块实验室胶带轻轻地将小鼠的四肢束缚在轮床上（图 1.16）。
9. 束缚鼠标后，将金属丝扭结带绕在每个肢体上并拧紧，将鼠标固定在手腕和脚踝的轮床上（图 1.17）。在胸部周围放一条较大的扭结带，系得非常松散，这样老鼠的呼吸就不会受到限制。这将作为辅助约束机制，以防任何肢体约束装置松动。
10. 抬起鼠标的尾巴并将其放在左脚下方，以确保在将轮床插入减震管时它不会被夹住（图 1.18）。

4. 法学学士程序

1. 打开激波管的动物暴露部分并调整鼠标的方向，使其面向迎面而来的冲击波（图 1.19）。
2. 将轮床固定/悬挂在动物暴露部分（图 1.20）。
3. 关紧动物暴露部分的门，确保麻醉液流管不被门夹住（图 1.21）。
4. 将麻醉剂减少至 2.5-3% 异氟醚，在剩余的疗程中为 1 升/分钟。
5. 根据需要为系统供电（图 1.22）。
6. 找到并连接压缩氦气的供应管线（图 1.23、1.24）。
7. 离开喷砂室，进入相邻房间的喷砂管控制台，并确保喷砂室内没有人员或动物。
   注意：机构或运营条件可能需要听力保护。此类情况可能包括控制台与减震管位于同一开放空间的减震管布置。
8. 在控制台上，打开采集软件以记录爆炸事件（参见图 1.25 中的绿色框）。
   注意：对于这些程序，我们以 20 千克赫兹 （kHz） 的采样率收集传感器数据，然后使用 LabView 软件进行处理。我们建议以 ≥10 kHz 的频率采集传感器采样，以获得高质量的时间与压力曲线。
9. 松开任何安全锁（例如，电源控制键，如图 1.26 中的绿色箭头所示）。
10. 关闭两个排气口并被动地对阀芯加压（图 1.27）。请勿使用驾驶员侧。继续填充，直到膜在目标峰 psi 处自行破裂，该峰由使用的膜片数量决定。
11. 记录动物位置的峰值压力、正相位持续时间和脉冲。（图 1.28）。关闭填充机制。
12. 返回减震管，断开氦气进料管，并关闭爆炸控制电路的电源（图 1.29）。
13. 要对同一只动物进行重复的 LLB 暴露，请打开线轴，取出线轴膜堆栈，然后滚动并插入另一个线轴膜堆栈（图 1.30、1.31、1.32）。展平膜堆栈并重新合上组件。
    注意：为了模拟经验定义的 SOF 训练期间低水平爆炸暴露的临床体验，我们每天将小鼠暴露于 5-6 个 LLB，将每日暴露限制在保守的 ~20 累积总 psi⁴⁵。强调机制和剂量-反应关系的研究可以选择使用一致数量的 LLB 暴露，每次会话具有定义的超压参数。
14. 在当前动物的最终 LLB 之后，将其从休克管中取出，保持麻醉开启（图 1.33）。
15. 在动物处于麻醉状态时解开动物的绳子。将其从麻醉鼻锥中取出，将其仰卧在加热的水垫上（图 1.34）。
16. 一旦动物被放在水垫上，启动一个计时器并记录鼠标自行翻转到其腹侧（即胃）的时间（图 1.35）。将此时间记录为扶正时间。鼠标恢复后，将其放回笼子并根据需要继续监控。

5. 多日程序

1. 为了模拟 SOF 近距离战斗训练期间使用的违规指控的常规 LLB 暴露，每周 5 天（周一至周五）每天对小鼠进行重复暴露，总共 15 天，共 3 个标准工作周。

6. 改变 LLB 峰值压力

1. 通过使用更坚固的膜材料或简单地堆叠额外的膜来提高峰值压力。例如，使用 Mylar Roll Clear 0.005 （500 G） 膜产生 ~20 psi 峰值压力（当用作驱动膜和阀芯膜时）或 Mylar Roll Clear 0.002 （200 G） 膜产生 ~10 psi 峰值压力。
2. 调整 blast 的正相位持续时间和脉冲参数，以满足实验需求。要调整正相位持续时间和脉冲，请通过替换压缩气源^47,49 或尽可能更改驱动器长度来凭经验确定目标条件。上述协议使用氦气产生类似于理想化的弗里德兰德曲线的尖锐峰值压力和波形。

7. 组织采集

注：组织采集实践可根据实验需要进行调整。

1. 通过腹膜内注射 210 mg/kg 戊巴比妥麻醉小鼠。
2. 将鼠标放入带有杆或预制网格的小鼠或鼠笼中;将笼式鼠标放入通风橱中。
3. 一旦鼠标没有反应，将其仰卧在笼子顶部的杆上，并在其中一根杆周围闭上嘴巴，以帮助它在灌注期间保持原位。
4. 抓住胃的皮肤，向上拉，用一把大剪刀在腹腔上剪一个洞，小心不要割伤任何器官。继续沿着肋骨底部向下切得更远，以便更自由地铰接胸腔。
5. 使用止血钳，从侧面接近鼠标，直接抓住胸腔顶部的组织，将止血钳向后滚动，以保持胸腔底部的角度处于易于接近的位置。使用一把镊子或类似工具将止血钳固定到位。
6. 使用一把小手术剪刀，小心地剪断隔膜，以便进入心脏。使用一对镊子轻轻地调整心脏的角度，使底部直接面向胸腔的开放底部。快速工作，使心脏在灌注期间仍会跳动。
7. 如果采集血液，用一对镊子夹住心脏，并使用 3 mL 注射器小心地刺穿右心室，注射器尖端有 0.5 英寸 25 G 针头。从心室底部插入并纵向插入，注意不要刺穿心室的另一侧。轻轻拉动注射器，直到收集到 0.5-1.0 mL 血液或血流停止，然后取出注射器。
8. 用一把手术剪刀在右心房切一个小切口，让血液和灌注液排出。用一对镊子夹住心脏，小心地将 25 G 蝶针从底部插入左心室。用固定夹或用手将蝶针固定到位。
9. 灌注动物。
   1. 将装有 50 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的注射器连接到蝶形针头上，并以大约 10 mL/min 的速率灌注。寻找肝脏漂白作为适当灌注的标志。注射器排空后，将其与蝶形针头断开。
   2. 为了制备用于显微镜的组织，用含有 50 mL 10% 中性缓冲福尔马林 （NBF） 或 4% 甲醛溶液的注射器替换空的 PBS 注射器。重复上述步骤以灌注福尔马林。
      注意：应观察灌注小鼠在灌注过程中抽搐;这应该会导致手术完成后全身僵硬或僵硬。
10. 从心脏中取出蝶针，从笼杆中取出鼠标以进行组织收集。
11. 根据需要对靶器官进行切除和细分;收集新鲜、未固定的材料时，请小心在冰上执行程序。
12. 快速冷冻在液氮中收集的任何未固定组织，并将其储存在 -80 °C 下，直至用于检测蛋白质或 RNA 靶标的方案。
13. 对于固定组织，取出到装有福尔马林的标记 50 mL 锥形管中（每个器官 1 管）。

讨论

我们无法充分治疗我们不充分理解的东西，我们还不了解与高度重复的 LLB 暴露相关的损伤机制。许多 SOF 人员报告说，在运营服务的 5 到 10 年内，被认为与高度重复的 LLB 暴露有关的健康相关损害的发展^50,51。一些 SOF 人员在接触 LLB 后立即出现急性创伤性脑损伤 （TBI） 样神经认知影响³⁹。此外，临床医生报告说，原始细胞暴露引起的症状通常对传统治疗无效，这可能促使 SOF 和临床医生寻求替代疗法^52,53。尽管 SOF 经常暴露于 LLB 和超压机制⁴⁵，由此产生的症状的严重程度和治疗耐药性，以及记录在案的与爆炸相关的星形胶质细胞瘢痕形成模式⁵¹，但长期健康结果仍然相对未知。临床医生和军队领导依靠建模研究来揭示损伤机制和病理生理学。这些模型对于制定早期识别、中断、预防和治疗病理过程的政策和策略至关重要。

至关重要的是，常见军用 LLB 暴露的小鼠建模有望为健康预测模型提供信息。临床实践将受益于 LLB 预测模型，这些模型可以确定谁可能最有可能患上与爆炸相关的病理，哪些爆炸特性会引发最严重的后果，以及疾病过程如何根据爆炸暴露的慢性性、剂量或特异性而演变。因此，对重复的 LLB 暴露进行建模对于开发暴露将如何影响 SOF 和其他服务成员的健康结果的假设和预测至关重要。预测和伤害机制模型将为诊断和治疗以及基于症状和暴露的重返工作岗位决策提供信息。

近年来，小鼠爆炸诱导的 TBI （bTBI） 的研究取得了重大进展，特别是随着预测人类慢性重复轻度 bTBI 后结果的模型的开发^54,55。虽然使用电击管对中高水平爆炸暴露的研究已经发展成熟，有数百篇 PubMed 索引文章 46,56,57,58，但在常规军事训练超压（<6 psi 峰值压力⁴⁰）附近的爆炸研究中使用电击管的使用不太发达，在最近的 PubMed 搜索中确定的文章不到^{10 篇 19,20，} 22,23,26,27,28。为了促进这个研究不足的领域的发展，所提出的模型侧重于小鼠持续 LLB 超压、爆炸后恢复和监测的关键考虑因素，同时指出该模型相对于使用露天炸药的几个明显优势。事实上，我们认为所描述的实验室 LLB 模型可能能够开发慢性重复 LLB 后临床结果的预测模型。

与开场爆炸模型相比，LLB 模型具有关键优势，尤其是在动物福利方面。旷场模型可能导致 3-8% 的死亡率^25,36，而这种基于实验室的 LLB 模型显示没有损失。这种区别至关重要，尤其是在模拟军事训练典型的高累积暴露时，几乎没有受训者会因 LLB 暴露而经历致命后果。明显不存在呼吸暂停或其他死亡原因，例如致命的肺外伤，确保了该模型的可靠性和一致性，使其成为重复 LLB 临床相关影响研究的首选。

该协议专用于具有三部分设计的“开放式”减震管，由驱动器、阀芯和从动部分组成。高度重复的 LLB 可以通过其他减震管设计来实现，只需对方案进行适当修改即可。开放式减震管设计经常用于爆炸引起的神经创伤的研究 46,47,48。开口激波管具有开放的出口端，允许产生的冲击波在离开管的另一端之前，沿着与目标（例如，动物受试者）相遇的管子长度自由传播。这种设计有助于再现和研究相对纯净的初级爆炸超压，近似于爆炸爆炸的特性，因为它们发生在开阔场地⁴⁸。因此，将经验测量的爆炸超压波的保真度与理想化的弗里德兰德波进行了比较;这允许评估管材性能以产生特定的超压事件。为了模拟 LLB 暴露，我们使用了前面描述的⁴⁸ 个定制的开炸管，最初设计用于再现超过 200+ 磅三硝基甲苯 （TNT） 在 ~25 英尺的对峙距离下 HLB 爆炸的效果。为了实现高峰值超压，将气体加压到驱动器中，驱动器通过膜与阀芯隔开，从而密封驱动器中的气体。反过来，线轴也被另一个膜与开口部分隔开。第二个膜允许对阀芯单独加压。双腔系统允许驱动器中的气体加压超过膜的正常破裂点。发生这种情况是因为加压阀芯充当缓冲器，在驱动器和阀芯的界面处支撑膜，从而防止其破裂。当减震管操作员希望在目标压力下产生冲击波时，电子阀从阀芯中排出气体，迅速降低阀芯中的压力，并允许驱动部分的超压气体破裂驱动器和阀芯膜，并迅速向下扩展管的长度，在目标区域中遇到动物。能够研究这种设计的高性能管材中 LLB 的关键修改是，我们挡住了驱动器，并且仅将线轴与低阈值膜结合使用。

为了确保 LLB 实验的可靠性和可重复性，在设置过程中必须采取某些措施。将手臂和腿紧紧固定在手腕和脚踝处至关重要。这最大限度地减少了身体运动和爆炸暴露的可变性，并防止了可能混淆结果的意外伤害。此外，向内旋转手腕和脚踝有助于将附属物向动物中线移动，从而降低可能影响后续运动性能评估的远端损伤风险。头部的伸直和脊柱弯曲是确保受试者之间均匀爆炸暴露的另一个重要因素，因为它有助于减少运动范围的潜在差异。对于持续数天或数周的方案，建议增加用于麻醉的异氟醚的百分比。这种调整有助于在整个延长的实验期间保持一致的麻醉深度。根据我们的经验，增加 0.5% 的异氟醚就足以维持足够的麻醉。

然而，并非所有喷丸管设计都无法通过鼻锥进行麻醉输送，尤其是那些具有不允许将管插入驱动部分的完全封闭设计。在这种情况下，注射麻醉剂可能更可取。我们建议确定进行重复连续爆炸所需的时间，然后给予足够的麻醉剂以在整个手术过程中保持昏迷。在开发这种修改后的方法期间，可能需要进行额外的动物福利检查，以确保适当的麻醉维护。此外，使用注射剂可能会导致急性反应后监测（例如收集扶正时间测量值）变得不可能。

在动物研究中，伦理考虑至关重要，这种基于实验室的 LLB 模型结合了全面的爆炸后恢复和监测方案。密切观察爆炸暴露后的人道终点，包括呼吸困难、无法自行扶正、2 小时观察后不能走动状态、癫痫样运动、笨拙运动、视力障碍以及内出血或四肢骨折的证据。值得注意的是，LLB 原始小鼠在我们的实验中没有表现出任何这些情况。然而，在 HLB 期间可能会发生肢体骨折，通常是由于操作员错误。减轻这种风险包括在轮床固定期间将手和脚向动物中线旋转。这种技术可以防止爆炸风向后扫动附属物并折断相关的骨骼。

这种重复的法学学士模式的优势不仅限于道德考虑，还延伸到实践和方法方面。其基于实验室的设计消除了处理爆炸物的需要，从而提高了安全性和可访问性。该模型具有高度可重复性和可定制性，允许研究人员通过使用不同的气体类型、设备设置和膜强度来影响暴露参数。这里选择氦是因为它能够再现旷场爆炸动力学⁴⁹，可能提供可靠的基线 47,59,60。通过修改保留膜厚度或强度，凭经验调整峰值压力，从而能够根据特定的实验要求进行微调。最后，LLB 模型消除了季节性或天气变化对数据、动物暴露和其他实验因素的影响。这种一致性确保了稳健可靠的结果，使这种重复的 LLB 模型成为纵向和高度重复爆炸研究的宝贵工具。

了解与爆炸相关的神经创伤需要阐明损伤机制、爆炸强度指标和阈值。然而，爆炸情景中人脑损伤机制存在不确定性。以前提出的爆炸暴露后人体损伤的标准依赖于动物研究，但由于物种⁶¹ 的标量标准不完整，将这些研究直接应用于人类具有挑战性。鉴于存在公认的标准^62,63，基于动物体重的肺损伤量表是一个例外。然而，基于身体^64,65 或大脑质量⁶⁶ 的拟议脑效应缩放定律忽略了已知和未知的解剖学差异，尤其是关于大脑内部和周围的保护结构。质量缩放预测体型较小的物种受伤风险更高，这与鸟类 67,68,69 和人类 ⁷⁰ 的研究相矛盾。因此，制定准确的缩放定律需要对外部爆炸事件强度与跨物种内部大脑效应之间的关系进行实证理解。就 LLB 而言，对动物模型或人类的单次或慢性暴露知之甚少。因此，我们的方法可以催化在 LLB 强度范围内为未来缩放定律的发展提供信息所需的实证研究。

总之，这种基于实验室的冲击管模型代表了小鼠 LLB 暴露慢性影响研究的重大进展。通过结合对持续超压进行建模的程序，优先考虑爆炸后的恢复和监测，并突出相对于替代模型的独特优势，这种基于实验室的 LLB 模型可能为促进我们对与慢性 LLB 暴露相关的伤害的理解提供可靠且合乎道德的选择。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adroit Thermal Recirculating Heat Pump (120 V)	Parkland Scientific	HTP-1500
Copy paper, 75 g/m2 weight	Staples	897804
Disposable Absorbant Blue Pads	VWR	82020-845
Forane Inhalant Solution	MedLine	10019-360-60
Helium	Linde	UN1046
Laboratory tape (1")	VWR	89098-076
LabView software	Emerson	V 2011
Medical oxygen	Central Welding Supply	UN1072
Mylar, 0.005 thickness	Tapp Plastics	22934
Plastic cling wrap	Santa Cruz Biotechnology	sc-3687
Plastic twist ties	VWR	11215-940
Pneumatic Shocktube (with driver and spool sections; target area sized for mice, 20 kHz sampling rate pressure sensors, control and acquisition software)	BakerRisk, San Antonio, TX	custom
Reusable Heavy Duty Heating Pad (12" x 18")	Parkland Scientific	121218
Scissor-style, Rodent Ear Punch	Kent Scientific	INS750076-2
Sliding Top Chambers for Traditional Vaporizers	Kent Scientific	VetFlo-0530SM
VetFlo Isoflurane Vaporizer	Kent Scientific	VetFlo-1210S