質量分析法を用いたヒト脳オルガノイドの分子イメージング

要約

脳オルガノイドの質量分析イメージング(MSI)のための高度な方法が開発され、これらのモデル内の代謝物分布をマッピングできるようになりました。この技術は、初期発生時や疾患における脳の代謝経路や代謝物の特徴に関する洞察を提供し、ヒトの脳機能のより深い理解を約束します。

要約

脳オルガノイドモデルは、ヒトの脳の発達と機能を研究するための強力なツールとして機能します。最先端技術である質量分析イメージング(MSI)は、脂質、糖、アミノ酸、薬物、それらの代謝産物などの多様な分子のオルガノイド内の空間分布を、特定の分子プローブを必要とせずにマッピングすることを可能にします。高品質なMSIデータは、綿密なサンプル調製にかかっています。固定剤は極めて重要な役割を果たしますが、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒドなどの従来の選択肢や、スクロースなどの凍結保存薬は、組織代謝物に不注意で影響を与える可能性があります。最適な固定には、液体窒素中での瞬間凍結が必要です。しかし、小型オルガノイドの場合、オルガノイドをインキュベーターから直接温めた包埋溶液に移行させ、その後、ドライアイス冷却エタノールで凍結させるというアプローチがより適切です。もう1つの重要なステップは、クライオセクショニング前の埋め込みであり、従来のオプションではマトリックスの堆積とイオン化を妨げる可能性があるため、MSIと互換性のある材料も必要です。ここでは、ヒト脳オルガノイドの高分解能-MALDI-MSIに最適化されたプロトコールについて、サンプル調製、切片化、質量分析を用いたイメージングを含めて紹介します。この方法は、アミノ酸などの低分子代謝産物の分子分布を高い質量精度と感度で示しています。このように、脳オルガノイドの補完的な研究と組み合わせることで、初期の脳の発達、代謝細胞の運命の軌跡、および特徴的な代謝物の特徴を支配する複雑なプロセスを解明するのに役立ちます。さらに、オルガノイド内の分子の正確な位置に関する洞察を提供し、3D脳オルガノイドモデルの空間構成についての理解を深めます。この分野の進歩に伴い、MSIを活用して脳オルガノイドや複雑な生物学的システムを解明する研究が増え、ヒトの脳機能や発達の代謝的側面の理解を深めることが期待されています。

概要

初代組織幹細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)^1,2,3に由来するオルガノイドモデルは、臓器特異的な機能を厳密に模倣した3次元モデルを提供することで、ヒトの生物学研究を進歩させ、ヒトの発生、疾患メカニズム、創薬の研究を支援しています^4,5.このような状況では、脳オルガノイドの複雑さを解明することは、生理学的および病理学的^脳の発達を理解するために極めて重要であり^6,7、質量分析イメージング(^MSI)8,9などの技術が必要です。MSIは、従来の質量分析とは異なり、単一の組織切片内の数百から数千の生体分子をラベルフリーで直接マッピングすることを可能にし、特定の分子プローブを必要とせずに、脂質、ペプチド、アミノ酸、薬物、およびそれらの代謝産物のような分子の空間分布に関する詳細な洞察を提供します^10,11.さらに、MSI分子画像は、組織学的切片および免疫染色切片に共レジストレーションすることができ、組織の形態、細胞特異性、および分子含有量を包括的に把握することができます。

MSIは、オルガノイド研究に大きな期待を寄せており、疾患の分子基盤、遺伝的表現型の関係、および環境刺激に対する応答に関する洞察を提供します12,13,14,15。製薬業界では、MSIは前臨床モデルにおける薬物の吸収、分布、代謝、および排泄の解析を容易にします^11,16。さらに、それはそれらの生体内変換された代謝産物の分離を助け、これは薬理学的に活性である可能性があります¹⁷。

MSI法では、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法(MALDI)、脱着エレクトロスプレーイオン化法(DESI)、二次イオン質量分析法(SIMS)が優勢です^{9,18,19,20,21}。これらのうち、MALDI-MSIは、その汎用性、広い質量範囲、直接分析機能、およびさまざまな組織特異的化合物との適合性で際立っています²²。しかし、その可能性にもかかわらず、MALDI-MSIの脳オルガノイド研究への応用は未だに未開拓です。このギャップに対処するために、脳オルガノイドの高分解能MALDI-MSI(HR-MALDI-MSI)解析のためのカスタマイズされたプロトコルが導入され、組織の保存、マトリックス選択、およびイメージング条件を最適化し、高品質のデータを確実に取得できるようになりました¹⁵。この詳細なプロトコルは、HR-MALDI-MSIの能力を示しており、この技術の力を活用してオルガノイドの代謝状況をこれまでにない詳細に探索するための追加の武器を研究者に提供します。

プロトコル

プロトコルの一般的なオーバーフローを 図 1 に示します。本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 脳オルガノイド切片の作製

1. 以前に発表された報告^23,24に従って、人工多能性幹細胞(iPSC)から脳オルガノイド(培養で30〜60日に達すると2〜3mmのサイズ)を調製し、ワイドボアチップを使用して所望の時間にそれらを収集します。
   1. 調製したオルガノイドを、CaCl₂ およびMgCl₂ を含まない1x Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で室温で3回洗浄して培地をすすぎ、次に室温の蒸留水で非常に迅速にDPBSからの塩を洗い流します。
2. ゼラチン(100 mLのDPBSに10 mg)を70〜80°Cで2時間攪拌して加熱することにより、冷たい魚の皮からゼラチン溶液10%を調製し、次に溶液を37°Cインキュベーターに30分間移動して気泡を除去し、オルガノイドを成長させたインキュベーターの温度に平衡化します。
   注:各実験で新鮮なゼラチンを調製することをお勧めしますが、必要に応じて最大1週間使用できます(4°Cで保存)。ゼラチンは室温で固化するため、液状になるためには包埋液として使用する前に温める必要があります。
3. プラスチック型(25 mm x 20 mm x 5 mm)の中央にオルガノイドを小さなピペットチップで固定し、オルガノイドが完全に浸るまで(型が約半分満たされるまで)10%ゼラチン包埋溶液を型に静かに注ぎます。
   1. 冷たい100%エタノールを入れたドライアイスの上のシャーレに型を入れて、急速に凍結します(1〜2分)。完全に凍結したら、色が白一色に変わったことが証明されるように、オルガノイド-ゼラチンブロックをペトリ皿から取り出し、アルミホイルで包むか、水の集中を防ぐために密封したブリキカップに入れ、凍結切片の準備ができるまで-80°Cで保存します。
4. クライオセクショニングでは、オルガノイドを含むプラスチックブロックをクライオチャンバー内に-20°Cから-25°Cで10〜15分間置き、チャンバー温度と平衡化します。オルガノイドをクライオトームを用いて14 μmの切片に切片化し、MSI用の酸化インジウムスズ被覆ガラススライド(ITOスライド)に融解します。
5. 質量分析計で構造的に均一な切片をすぐにスキャンするか、容器に密封して-80°Cで保存し、後の研究に備えます。

2. MALDI-MSIのマトリックス調製と応用

1. MALDI-MSIの場合、スライドをスプレーし、組織切片をマトリックス、異なる代謝産物のイオン化を助ける有機化合物でコーティングします²⁵。異なる分子種のイメージングには、さまざまなマトリックスが使用されます。したがって、まず、研究に最も適したマトリックスを選択する必要があります。
   注:この研究は、ミトコンドリア代謝経路に関連する小さな代謝物とアミノ酸の局在と分布に焦点を当てており、それに応じてマトリックスが選択されました(脂質のマッピングについては、Cappuccioらを参照してください)。¹⁵.
2. まず、-80°CからITOスライドを取り出したら、すぐにスライドをデシケーターに20分間入れて、表面の大気中の水の結露を最小限に抑えます。
3. N-(1-ナフチル)エチレンジアミン二塩酸塩(NEDC)を調製します。これは、500 Da²⁶のm / z未満のバックグラウンドシグナルを妨げることなく、目的の分析物の強力なシグナルを提供するため、小さな代謝物に適したマトリックスです。スライド乾燥後、加熱された空気圧噴霧器を使用して、70%メタノール中の10 mg/mL NEDC溶液をオルガノイド切片にスプレーします。
4. ノズル温度 = 75 °C、ノズル速度 = 1,250 mm/分、ポンプ流量 = 100 μL/分、パス数 = 8、トラック間隔 = 2.5 mm、ガス流量 3L/分、乾燥時間 = 10 秒、窒素ガス圧力 10 psi です。

3. MALDI-MSI計測器

1. 脳オルガノイド代謝物を可視化するための高分解能MALDI-MSIプラットフォームを実現するには、デュアルイオンファンネルインターフェースを備えたMALDIイオン源を質量分析計にマウントします。
2. 波長349 nm、繰り返し周波数1 kHz、パルスエネルギー約1.3〜1.4 μJの接続されたQスイッチ周波数3倍Ndレーザーを使用します。
3. オーバーサンプリングを避けるために、レーザーを直径~15μmのスポットサイズに集束させます。
4. サンプルをMALDIインジェクターステージに取り付けます。高圧イオンファンネルを7.4〜7.5 Torrで操作および維持し、低圧イオンファンネルを1.6〜1.8 Torrに保ちます。
5. 高圧イオンファンネルには、それぞれ604 kHz、80 V0ピーク、780 kHz、191 V0ピークの無線周波数電圧を印加します。
6. 低質量範囲の低分子代謝物の感度を向上させるには、MALDI-MSI源の低圧および高圧漏斗のRF振幅をそれぞれ約20%および15%に減少させます。
7. 質量分解能を 70,000 に設定します。MALDIインジェクターソフトウェアで測定する領域とピクセルサイズ(25μm/ピクセル)を選択します。

4. MALDI-MSIデータ取得とデータ解析

1. m/zのm/z範囲80-900で、負イオンモードと正イオンモードの両方でデータを集録します。14 μmのオルガノイド切片について、ピクセルあたり25 μmの横方向の分解能でサンプルをスキャンします。
2. 質量分析計のイオン注入時間を250msに設定し、自動ゲイン制御(AGC)^をオフ26にしてプロファイルモードでフーリエ変換質量スペクトル(FTMS)を取得する。
3. NEDC マトリックスのピークを内部オンライン質量キャリブレーションとして使用すると、±5 ppm 未満の質量精度が得られます。
4. 互換性のあるソフトウェアを使用してデータを処理します。MSIスペクトルデータを直接ソフトウェアにインポートし、畳み込みアルゴリズムを使用してベースライン補正を実行し、総イオンカウント(TIC)を使用してデータを正規化します。
5. ビン幅 Δm/z = 0.01 または ±5 ppm を使用して、生データファイルからイオン画像の特徴リストを生成し、質量欠陥とピクセルカバレッジに基づいて m/z 画像を区別します。
6. 個々の代謝物イオン種から偽色(ジェット)またはRGB(赤-緑、青)の画像を生成します。MALDI-MSIから取得した生データファイルのm/zリストをHuman Metabolome Database(HMDB)にアップロードします(質量許容度<理論上のm/zに対して5ppm)代謝物を同定します。
   注:LC-MS/MS データから得られた代謝物の正確な質量、予測式、および構造は、代謝物の比較と同定のためにメタボロミクスデータベース(HMDB、Metlin など)を照会するためにも使用されます。

結果

これは、MSIを使用して分子(代謝)イメージングを最適化するプロトコルです(図1、Cappuccioらも参照してください)。¹⁵.最も信頼性の高いデータと組織形態の保存は、シリアルセクションの組織学的染色によって確認されたように、冷たい魚の皮からの10%ゼラチンで達成されました。60日間のヒト脳オルガノイドの魚ゼラチン包埋を使用して、MSIを使用してクレブス回路関連代謝物をマッピングし、その空間分布を示しました(図2)。

全体として、最適化されたプロトコルは一貫して堅牢な結果をもたらし、冷たい魚の皮から採取された 10% ゼラチンを好ましい埋め込み材料として使用し、NEDCマトリックススプレーの設定を微調整して画像の解像度を向上させました。脳オルガノイドで検出された小さな代謝物は、この組織の分子の複雑さに関する貴重な洞察を提供します。

図1:ヒト脳オルガノイドメタボローム研究の一般的なパイプライン。 誘導多能性幹細胞 を介して 個々の線維芽細胞に由来するオルガノイドは、代謝産物の空間分布を強調するためにLC-MSおよびMSIに使用されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:クレブスサイクル関連代謝物のマッピング。 MSIを使用した健康なコントロールに由来する60日間のオルガノイドを使用したクレブス回路関連代謝物の同定と分布。ヘマトキシリンとエオシンの染色が示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ヒト脳オルガノイドの高解像度MALDI-MSIのための洗練されたプロトコルは、結果の信頼性を確保するための重要なステップに細心の注意を払って対処します。サンプルの保存が最優先事項として浮上しており、組織の亀裂や損傷を回避するために、温めた包埋溶液とドライアイス冷却エタノールを含む代替凍結方法が提案されています。このプロトコールは、ヒト脳オルガノイド¹⁵のような微小サイズの組織に最も効果的である。最適切断温度(OCT)コンパウンドやホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)などの包埋材料は、マトリックスの堆積やイオン化に干渉するため、注意が必要です。代わりに、冷たい魚の皮からの10%ゼラチンが最適な包埋溶液として強調されており、クライオ切片¹⁵中の組織の完全性を維持する効果を示しています。さらに、マトリックスの選択と、ドライスプレーなどのその堆積技術は、低m/zの低分子代謝物の非局在化を最小限に抑え、画像解像度を向上させるために不可欠です。

このプロトコールの堅牢性と信頼性は、ヒト脳オルガノイド¹⁵の広範囲の分子の検出と可視化の成功によって実証されており、それらの空間分布と潜在的な生物学的意義についての貴重な洞察をもたらしています。これらの知見は、脳オルガノイド内の複雑な分子ランドスケープの理解を大幅に深め、脳の発達と機能を支える重要なシグナル伝達経路と代謝プロセスを解明します。

現在のデータは多様な種の局在化に関する新たな洞察を提供しますが、この研究で使用されたSpectroglyph MALDIイメージングソースは、まだシングルセルレベルの分解能(現在10~20μm)を達成していません。ブルカーのtimsTOFやWaterのMRTなどの他のプラットフォームは、5μmでシングルセルの分解能を提供できるため、実験に使用する機器を念頭に置くことが重要です。

このような制約にもかかわらず、脳オルガノイドの高解像度HR-MALDI-MSIは大きな期待を寄せています。オルガノイド内の代謝物と脂質の分布をマッピングする能力は、オルガノイドの発生と成熟に不可欠な代謝細胞の運命の軌跡、経路、および明確なシグネチャーに関するユニークなポイントを提供します。この方法論は、従来の組織学と分子解析の間の架け橋として機能し、ゲノム、現象、および環境応答の間の相互関係をより深く理解することを促進します。

要約すると、ヒト脳オルガノイドのHR-MALDI-MSIに最適化されたプロトコルは、オルガノイドモデルを探索する研究者にとって貴重な資産です。この方法は、重要なステップに細心の注意を払い、トラブルシューティングを行い、限界を認識することにより、脳の発達と機能を支える分子の複雑さをさらに解明するための基礎を築きます。MSIの技術が進化し、ますます利用しやすくなるにつれて、MSIは、初期のヒト発生、疾患モデリング、創薬についての理解を深める準備ができています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1S, 2S)-1,2-di-1-Naphthyl-ethylenediamine dihydrochloride	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	1052707-27-3	Matrix substance for MALDI-MS, ≥99.0% (HPLC)
1× Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Life Technologies, USA	14190-144	Without CaCl2 and MgCl2
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA	2069G	Reduce potential contamination
Cryomolds	Tissue-Tek	25608-916	Standard mold with flat-surface
Entellan	Fisher Scientific	M1079610500	Cover slips
Eosin Y	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	E511-25	Certified Biological Stain
Fish gelatin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	G7041	Powder form from cold water fish skin
Hematoxylin	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	517-28-2	Certified biological stain Elevated pressure imaging source with
HTX M5+ sprayer	HTX Technologies LLC, Carrboro, USA		Matrix sprayer
Indium tin	Hudson Surface Technology,	PL-IF-000010-P25	Provide a conductive surface for MALDI imaging
MALDI ion source	Spectroglyph LLC, USA		dual ion funnel interface
Methanol	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	67-56-1	HPLC grade
oxide (ITO) conductive–coated slides	New York, United States
Porcine gelatin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	G1890	Powder form from porcine skin
Q-Exactive mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA		High resolution mass spectrometry
SCiLS Lab software	version 2024a Pro		for processing the data
Water	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	W6500	HPLC grade
	(Waltham, MA, USA)