İnsan Beyni Organoidlerinin Kütle Spektrometresi Kullanılarak Moleküler Görüntülenmesi

Özet

Beyin organoidlerinin kütle spektrometresi görüntülemesi (MSI) için bu modeller içindeki metabolit dağılımlarının haritalanmasına izin veren gelişmiş bir yöntem geliştirilmiştir. Bu teknoloji, erken gelişim sırasında ve hastalıkta beyin metabolik yolları ve metabolit imzaları hakkında bilgi sunarak insan beyninin işlevinin daha derin bir şekilde anlaşılmasını vaat ediyor.

Özet

Beyin organoid modelleri, insan beyninin gelişimini ve işlevini incelemek için güçlü bir araç görevi görür. En son teknoloji olan kütle spektrometresi görüntüleme (MSI), lipitler, şekerler, amino asitler, ilaçlar ve bu organoidler içindeki metabolitleri gibi çeşitli moleküllerin uzamsal dağılımını haritalamamıza olanak tanır ve bunların tümünü belirli moleküler problara ihtiyaç duymadan yapar. Yüksek kaliteli MSI verileri, titiz numune hazırlığına dayanır. Fiksatifler çok önemli bir rol oynar, ancak glutaraldehit, paraformaldehit ve sükroz gibi kriyoprezervasyon gibi geleneksel seçenekler yanlışlıkla doku metabolitlerini etkileyebilir. Optimum fiksasyon, sıvı nitrojende hızlı dondurmayı gerektirir. Bununla birlikte, küçük organoidler için daha uygun bir yaklaşım, organoidlerin doğrudan inkübatörden ısıtılmış bir gömme çözeltisine dönüştürülmesini ve ardından kuru buzla soğutulmuş etanolde dondurulmasını içerir. Diğer bir kritik adım, geleneksel seçenekler matris birikimi ve iyonizasyonu ile etkileşime girebileceğinden, MSI ile uyumlu malzemeler de gerektiren kriyoseksiyondan önce gömmedir. Burada, kütle spektrometresi kullanılarak numune hazırlama, kesitleme ve görüntülemeyi kapsayan, insan beyni organoidlerinin yüksek çözünürlüklü-MALDI-MSI'si için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem, amino asitler gibi küçük metabolitlerin moleküler dağılımını yüksek kütle doğruluğu ve duyarlılığı ile gösterir. Bu nedenle, beyin organoidlerinin tamamlayıcı çalışmaları ile birleştiğinde, erken beyin gelişimini, metabolik hücre kader yörüngelerini ve ayırt edici metabolit imzalarını yöneten karmaşık süreçlerin aydınlatılmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, organoid içindeki moleküllerin kesin konumları hakkında bilgi sağlayarak, 3D beyin organoid modellerinin mekansal organizasyonu hakkındaki anlayışımızı zenginleştirir. Alan ilerlemeye devam ettikçe, beyin organoidlerini ve karmaşık biyolojik sistemleri araştırmak için MSI'dan yararlanan artan sayıda çalışma beklenmekte ve böylece insan beyni işlevinin ve gelişiminin metabolik yönlerinin anlaşılmasını derinleştirmektedir.

Giriş

Birincil doku kök hücreleri, embriyonik kök hücreler veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler⁾ türetilen organoid ^{modeller1,2,3}, organa özgü işlevleri yakından taklit eden, insan gelişimi, hastalık mekanizmaları ve ilaç keşfi çalışmalarına yardımcı olan üç boyutlu modeller sunarak insan biyolojisi araştırmalarını ilerletmiştir ^4,5. Bu bağlamda, beyin organoid karmaşıklıklarının çözülmesi, hem fizyolojik hem de patolojik beyin gelişimini anlamak için çok önemlidir ^6,7 ve kütle spektrometresi görüntüleme (MSI)^8,9 gibi teknolojileri gerektirir. MSI, geleneksel kütle spektrometresinden farklı olarak, tek bir doku bölümündeki yüzlerce ila binlerce biyomolekülün doğrudan, etiketsiz haritalanmasını sağlayarak, spesifik moleküler problara ihtiyaç duymadan moleküller benzeri lipitler, peptitler, amino asitler, ilaçlar ve bunların metabolitlerinin mekansal dağılımı hakkında ayrıntılı bilgiler sağlar^10,11. Ayrıca, MSI moleküler görüntüleri, doku morfolojisi, hücre özgüllüğü ve moleküler içeriğin kapsamlı bir görünümünü sağlayan histolojik ve immün boyalı bölümlere birlikte kaydedilebilir.

MSI, hastalıkların moleküler temeli, genetik-fenotip ilişkileri ve çevresel uyaranlara verilen yanıtlar hakkında içgörüler sunan^organoid araştırmaları için önemli bir umut vaat etmektedir 12,13,14,15. İlaç endüstrisinde MSI, klinik öncesi modellerde ilaç emilimi, dağılımı, metabolizması ve eliminasyonu analizlerini kolaylaştırır ^11,16. Ayrıca, farmakolojik olarak aktif olabilen biyolojik olarak dönüştürülmüş metabolitlerinin çözülmesine yardımcı olur¹⁷.

MSI yöntemleri arasında, matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI), desorpsiyon elektrosprey iyonizasyonu (DESI) ve ikincil iyon kütle spektrometresi (SIMS)^baskındır 9,18,19,20,21. Bunlardan MALDI-MSI, çok yönlülüğü, geniş kütle yelpazesi, doğrudan analiz yetenekleri ve çeşitli dokuya özgü kimyasal bileşiklerle uyumluluğu ile öne çıkmaktadır²². Bununla birlikte, potansiyeline rağmen, MALDI-MSI'nin beyin organoid araştırmalarındaki uygulaması yeterince araştırılmamıştır. Bu boşluğu gidermek için, doku koruma, matris seçimi ve görüntüleme koşullarını optimize etmek ve yüksek kaliteli verilerin güvenilir bir şekilde elde edilmesini sağlamak için beyin organoidlerinin yüksek çözünürlüklü MALDI-MSI (HR-MALDI-MSI) analizi için özel bir protokol tanıtılmıştır¹⁵. Bu ayrıntılı protokol, HR-MALDI-MSI'nin araştırmacılara, organoidlerin metabolik manzarasını benzeri görülmemiş ayrıntılarla keşfetmek için bu teknolojinin gücünden yararlanmaları için ek cephanelik sağlama yeteneklerini sergiliyor.

Protokol

Protokolün genel taşması Şekil 1'de gösterilmiştir. Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Beyin organoid kesit hazırlığı

1. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC) beyin organoidlerini (kültürde 30-60 güne ulaştıklarında 2-3 mm boyutunda) daha önce yayınlanmış raporlara^23,24 uygun şekilde hazırlayın ve geniş delikli uçlar kullanarak istenen zamanda toplayın.
   1. Hazırlanan organoidleri, ortamı durulamak için oda sıcaklığında CaCl₂ ve MgCl₂ içermeyen 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) ile üç kez yıkayın ve ardından DPBS'den herhangi bir tuzu durulamak için oda sıcaklığında damıtılmış su ile çok hızlı bir şekilde yıkayın.
2. Jelatini (100 mL DPBS'de 10 mg) 2 saat boyunca 70-80 ° C'de karıştırarak ve ısıtarak soğuk balık derisinden% 10 jelatin çözeltisi hazırlayın, ardından çözeltiyi 30 dakika boyunca 37 ° C inkübatöre taşıyın kabarcıkları çıkarmak ve organoidlerin yetiştirildiği inkübatörün sıcaklığına dengelemek için.
   NOT: Her deney için jelatinin taze olarak hazırlanması tavsiye edilir, ancak gerekirse 1 haftaya kadar (4 °C'de saklayın) kullanılabilir. Jelatin oda sıcaklığında katılaşır ve sıvı hale gelmesi için bir gömme çözeltisi olarak kullanılmadan önce ısıtılması gerekir.
3. Organoidi küçük pipet ucuyla plastik bir kalıbın ortasına (25 mm x 20 mm x 5 mm) sabitleyin ve %10 jelatin gömme solüsyonunu organoid tamamen daldırılana kadar kalıba yavaşça dökün (kalıp yaklaşık olarak yarı dolu olmalıdır).
   1. Kalıbı hızlı bir şekilde dondurmak için (1-2 dakika) soğuk% 100 etanol içeren kuru buz üzerinde bir Petri kabına yerleştirin. Tamamen donduğunda, rengin katı beyaza dönüşmesiyle kanıtlandığı gibi, organoid-jelatin bloğunu Petri kabından çıkarın, alüminyum folyoya sarın veya su konsantrasyonunu önlemek için kapalı bir teneke kaba koyun ve kriyoseksite hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın.
4. Kriyoseksiyon için, organoidler içeren plastik blokları, oda sıcaklığı ile dengelemek için 10-15 dakika boyunca -20 °C ila -25 °C arasında kriyo odasına yerleştirin. MSI için indiyum kalay oksit kaplı cam slaytlar (ITO slaytları) üzerine kriyotom ve çözülme montajı kullanarak organoidleri 14 μm'lik bölümlere ayırın.
5. Kütle spektrometresinde yapısal olarak tekdüze bölümleri hemen tarayın veya bunları kabın içine kapatın ve daha sonraki çalışmalar için -80 ° C'de saklayın.

2. MALDI-MSI için matris hazırlama ve uygulama

1. MALDI-MSI için, slaytları püskürtün ve doku bölümlerini farklı metabolitleri iyonize etmeye yardımcı olan organik bir bileşik olan matris ile kaplayın²⁵. Farklı molekül türlerini görüntülemek için farklı matrisler kullanılır; Bu nedenle öncelikle çalışma için en uygun matris seçilmelidir.
   NOT: Bu çalışma, mitokondriyal metabolik yolaklarla ilgili küçük metabolitlerin ve amino asitlerin lokalizasyonu ve dağılımına odaklanmış ve matris buna göre seçilmiştir (lipitlerin haritalanması için lütfen bakınız Cappuccio ve ark.)¹⁵.
2. İlk olarak, ITO slaytlarını -80 °C'den çıkardıktan sonra, yüzeylerdeki atmosferik suyun yoğunlaşmasını en aza indirmek için slaytı hemen 20 dakika boyunca bir kurutucuya koyun.
3. 500 Da^26'nın m / z altında arka plan sinyallerine müdahale etmeden ilgilenilen analitin güçlü bir sinyalini verdiği için küçük metabolitler için uygun bir matris olan N- (1-naftil) etilendiamin dihidroklorür (NEDC) hazırlayın. Isıtılmış bir pnömatik püskürtücü kullanarak slayt kurutma işleminden sonra organoid bölümlere %70 metanol içinde 10 mg / mL NEDC çözeltisi püskürtün.
4. Matris püskürtücü parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: nozul sıcaklığı = 75 °C, nozul hızı = 1.250 mm/dak, pompa akış hızı = 100 μL/dak, geçiş sayısı = 8, iz aralığı = 2,5 mm, gaz akış hızı 3L/dak, kuruma süresi =10 s ve 10 psi nitrojen gazı basıncı.

3. MALDI-MSI enstrümantasyonu

1. Beyin organoid metabolitlerini görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü bir MALDI-MSI platformu elde etmek için, çift iyon huni arayüzlü bir MALDI iyon kaynağını bir kütle spektrometresine monte edin.
2. 349 nm dalga boyuna, 1 kHz tekrarlama oranına ve yaklaşık 1.3-1.4 μJ darbe enerjisine sahip bağlı Q anahtarlı, frekans üçlü Nd lazer kullanın.
3. Aşırı örneklemeyi önlemek için lazeri ~15 μm çapında bir nokta boyutuna odaklayın.
4. Numuneyi MALDI enjektör aşamasına takın. Yüksek basınçlı iyon hunisini 7.4-7.5 Torr'da çalıştırın ve bakımını yapın ve düşük basınçlı iyon hunisini 1.6-1.8 Torr'da tutun.
5. Yüksek ve düşük basınçlı iyon hunilerine sırasıyla 604 kHz, 80 V0 tepe ve 780 kHz, 191 V0 tepe radyo frekansı voltajları uygulayın.
6. Düşük kütle aralığındaki küçük metabolitler için duyarlılığı artırmak için, MALDI-MSI kaynağının düşük ve yüksek basınç hunisindeki RF genliklerini sırasıyla yaklaşık% 20 ve% 15'e düşürün.
7. Kütle çözünürlüğünü 70.000 olarak ayarlayın. MALDI enjektör yazılımında ölçülecek alanı ve piksel boyutunu (25 μm/piksel) seçin.

4. MALDI-MSI veri toplama ve veri analizi

1. Hem negatif hem de pozitif iyon modlarında 80-900 m/z aralığında veri elde edin. Numuneleri 14 μm organoid bölümler için piksel başına 25 μm yanal çözünürlükle tarayın.
2. Kütle spektrometresinde iyon enjeksiyon süresini 250 ms'ye ayarlayın ve otomatik kazanç kontrolü (AGC)^{kapalıyken profil modunda Fourier} Dönüşümü Kütle Spektrumları (FTMS) elde edin 26.
3. NEDC matris tepe noktalarını dahili bir çevrimiçi kütle kalibrasyonu olarak kullanın, bu da ±5 ppm'den daha iyi bir kütle doğruluğu sağlar.
4. Verileri işlemek için uyumlu yazılım kullanın. MSI spektral verilerini doğrudan yazılıma aktarın, ardından bir evrişim algoritması kullanarak temel düzeltme yapın ve toplam iyon sayısını (TIC) kullanarak verileri normalleştirin.
5. M/z görüntülerini kütle kusuru ve piksel kapsamına göre ayırt etmek için Δm/z = 0,01 veya ±5 ppm bölme genişliği kullanarak ham veri dosyalarından iyon görüntülerinin özellik listesini oluşturun.
6. Tek tek metabolit iyon türlerinden sahte renkli (Jet) veya RGB (kırmızı-yeşil ve mavi) görüntüler oluşturun. Metabolitleri tanımlamak için MALDI-MSI'dan elde edilen ham veri dosyalarının m/z listesini İnsan Metabolom Veritabanına (HMDB) yükleyin (teorik m/z'ye göre kütle toleransı <5 ppm).
   NOT: LC-MS/MS verilerinden elde edilen metabolitin tam kütlesi ve tahmin edilen formülü ve yapısı, metabolit karşılaştırması ve tanımlaması için metabolomik veritabanlarını (örneğin, HMDB, Metlin) sorgulamak için de kullanılır.

Sonuçlar

İşte MSI kullanarak moleküler (metabolik) görüntülemeyi optimize eden bir protokol (Şekil 1, lütfen ayrıca bakınız Cappuccio ve ark.)¹⁵. En güvenilir veriler ve doku morfolojisinin korunması, seri kesitlerin histolojik boyanmasıyla doğrulandığı gibi, soğuk balık derisinden elde edilen %10 jelatin ile elde edildi. 60 günlük insan beyni organoidlerinin balık jelatini gömülmesi kullanılarak, Krebs döngüsü ile ilgili metabolitler, mekansal dağılımlarını gösteren MSI kullanılarak haritalandı (Şekil 2).

Genel olarak, optimize edilmiş protokol, tercih edilen gömme malzemesi olarak soğuk balık derisinden elde edilen %10 jelatin ve görüntü çözünürlüğünü artırmak için ince ayarlanmış NEDC matris sprey ayarları ile sürekli olarak sağlam sonuçlar verdi. Beyin organoidlerinde tespit edilen küçük metabolitler, bu dokunun moleküler karmaşıklıkları hakkında değerli bilgiler sağlar.

Şekil 1: İnsan beyni organoid metabolom çalışmasının genel boru hattı. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler yoluyla bireyin fibroblastlarından türetilen organoidler, metabolitlerin mekansal dağılımını vurgulamak için LC-MS ve MSI için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Krebs döngüsü ile ilgili metabolitlerin haritalanması. MSI kullanılarak sağlıklı kontrollerden türetilen 60 günlük organoidler kullanılarak Krebs döngüsü ile ilgili metabolitlerin tanımlanması ve dağılımı. Hematoksilen ve eozin boyaması gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

İnsan beyni organoidlerinin yüksek çözünürlüklü MALDI-MSI'si için rafine edilmiş protokol, sonuçların güvenilirliğini sağlamak için önemli adımları titizlikle ele alır. Numunenin korunması çok önemli hale gelir ve doku çatlamasını ve hasarını önlemek için, ısıtılmış bir gömme çözeltisi ve kuru buzla soğutulmuş etanol içeren alternatif bir dondurma yöntemi önerilmektedir. Bu protokol, insan beyni organoidleri¹⁵ gibi çok küçük boyuttaki dokular için en iyi sonucu verir. Optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği ve Formalin-Sabit Parafin Gömme (FFPE) gibi gömme malzemeler, matris biriktirme ve iyonizasyon ile etkileşimleri nedeniyle uyarılır. Bunun yerine, soğuk balık derisinden elde edilen %10'luk jelatin, kriyo-kesit¹⁵ sırasında doku bütünlüğünü korumadaki etkinliğini sergileyen en uygun gömme çözümü olarak vurgulanır. Ayrıca, düşük m/z küçük metabolitlerin delokalizasyonunu en aza indirmek ve görüntü çözünürlüğünü artırmak için matris seçimi ve kuru püskürtme gibi biriktirme teknikleri zorunludur.

Protokolün sağlamlığı ve güvenilirliği, insan beyni organoidlerindeki¹⁵ geniş bir molekül spektrumunun başarılı bir şekilde tespit edilmesi ve görselleştirilmesiyle doğrulanır ve mekansal dağılımları ve potansiyel biyolojik önemleri hakkında paha biçilmez bilgiler sağlar. Bu bulgular, beyin organoidleri içindeki karmaşık moleküler manzaranın anlaşılmasını önemli ölçüde artırarak, beyin gelişimini ve işlevini destekleyen önemli sinyal yollarını ve metabolik süreçleri aydınlatmaktadır.

Mevcut veriler, çeşitli türlerin lokalizasyonu hakkında yeni bilgiler sağlarken, bu çalışmada kullanılan Spektroglif MALDI görüntüleme kaynağı henüz tek hücre düzeyinde çözünürlüğe ulaşmamıştır (şu anda ~ 10-20 μm'de). Bruker'in timsTOF'u ve Water'ın MRT'si gibi diğer platformlar, 5 μm'de tek hücreli çözünürlük sağlayabilir ve bu nedenle, deney için kullanılacak cihazı akılda tutmak önemlidir.

Bu kısıtlamalara rağmen, beyin organoidlerinin yüksek çözünürlüklü HR-MALDI-MSI önemli bir umut vaat ediyor. Organoidler içindeki metabolit ve lipid dağılımlarını haritalama yeteneği, organoid gelişimi ve olgunlaşması için çok önemli olan metabolik hücre kaderi yörüngeleri, yolları ve farklı imzalar üzerinde benzersiz bir nokta sunar. Bu metodoloji, geleneksel histoloji ve moleküler analiz arasında bir köprü görevi görerek genom, fenom ve çevresel tepkiler arasındaki bağlantıların daha derin bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştırır.

Özetle, insan beyni organoidlerinin HR-MALDI-MSI için optimize edilmiş protokolü, organoid modellerini araştıran araştırmacılar için değerli bir varlık oluşturmaktadır. Bu yöntem, kritik adımları titizlikle ele alarak, sorun gidererek ve sınırlamaları kabul ederek beyin gelişimini ve işlevini destekleyen moleküler karmaşıklıkların daha fazla aydınlatılması için zemin hazırlar. MSI teknolojisi geliştikçe ve giderek daha erişilebilir hale geldikçe, erken insan gelişimi, hastalık modellemesi ve ilaç keşfi konusundaki anlayışımızı geliştirmeye hazırlanıyor.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1S, 2S)-1,2-di-1-Naphthyl-ethylenediamine dihydrochloride	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	1052707-27-3	Matrix substance for MALDI-MS, ≥99.0% (HPLC)
1× Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Life Technologies, USA	14190-144	Without CaCl2 and MgCl2
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA	2069G	Reduce potential contamination
Cryomolds	Tissue-Tek	25608-916	Standard mold with flat-surface
Entellan	Fisher Scientific	M1079610500	Cover slips
Eosin Y	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	E511-25	Certified Biological Stain
Fish gelatin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	G7041	Powder form from cold water fish skin
Hematoxylin	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	517-28-2	Certified biological stain Elevated pressure imaging source with
HTX M5+ sprayer	HTX Technologies LLC, Carrboro, USA		Matrix sprayer
Indium tin	Hudson Surface Technology,	PL-IF-000010-P25	Provide a conductive surface for MALDI imaging
MALDI ion source	Spectroglyph LLC, USA		dual ion funnel interface
Methanol	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	67-56-1	HPLC grade
oxide (ITO) conductive–coated slides	New York, United States
Porcine gelatin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	G1890	Powder form from porcine skin
Q-Exactive mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA		High resolution mass spectrometry
SCiLS Lab software	version 2024a Pro		for processing the data
Water	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	W6500	HPLC grade
	(Waltham, MA, USA)