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要約

このプロトコルでは、軟骨細胞、フィブロネクチン接着アッセイ由来軟骨形成因子(FAA-CP)、およびヒト関節軟骨からの移動性軟骨形成因子(MCP)の単離について詳しく説明します。酵素消化、フィブロネクチン接着、およびこれらの細胞を単離および特性評価するための遊走ベースのアッセイをカバーしています。

要約

軟骨形成細胞(CPC)は、最近、別個の亜集団として同定され、その間葉系特性、軟骨新生の亢進、および肥大形質の制限により、有望な結果を示しています。前駆細胞の濃縮は、フィブロネクチン接着法および遊離体ベースの外植片アッセイによって達成され、フィブロネクチン接着法由来軟骨形成剤(FAA-CP)および移動性軟骨形成剤(MCP)は、軟骨細胞と比較して優れた可能性を示しています。この記事では、常在軟骨由来細胞、すなわち軟骨細胞と軟骨形成細胞の単離について詳しく説明します。軟骨細胞の研究から得られる貴重な知見は、軟骨修復の理解に貢献していますが、軟骨形成薬の使用と、代替治療アプローチとしてのその可能性を探ることに継続的な取り組みが向けられています。さらに、この方法論の記事では、軟骨細胞、FAA-CP、およびMCPの3つの特定の細胞タイプを軟骨から単離するための詳細なステップバイステップのプロトコルを提供します。標準化された手順に従うことにより、このプロトコルはこれらの細胞サブタイプの抽出を容易にします。広範な研究に基づいて、この記事は、さまざまなサブセットを分離するために利用される複雑な技術と、それらの培養を拡大および維持するために必要な最適化された培養条件に焦点を当てています。この方法論には、ヒト関節軟骨由来軟骨細胞の酵素的単離、逐次酵素消化後のフィブロネクチン接着の違い、軟骨常在細胞を得るための遊走ベースの外植片アッセイが含まれます。

概要

細胞ベースの再生治療の出現は、変形性関節症(OA)や軟骨欠損症などの軟骨関連疾患の治療に対する重要なアプローチを表しています1。関節内の軟骨の破壊または損傷を特徴とするこれらの障害は、治療中に大きな課題を提示します。関節軟骨の自己修復は、その非神経構造、無血管性、および低い有糸分裂活動のために限定的であると報告されています2。

軟骨組織の再生に最も利用されている細胞は、間葉系幹細胞(MSC)と軟骨細胞3です。しかし、いくつかの研究では、これらの細胞を再生に使用することには限界があることが報告されています4。これらの制限には、必要な細胞数を達成するための拡張in vitro拡張中の軟骨細胞の末端分化とMSCの肥大傾向が含まれます。これらの要因は、線維軟骨と硝子体5,6,7,8の最適でない組み合わせで修復組織の形成をもたらす可能性があります。

軟骨形成細胞(CPC)の発見は、関節軟骨9における代替細胞の探求から生じました。それらは、MSCに類似していることと優れた軟骨形成能により、大きな関心を集めていますが、10,11の後に求められている不可欠な組み合わせである肥大の減少を示しています。軟骨細胞とは対照的に、これらの前駆細胞集団は、増強された複製活性およびテロメラーゼ活性を示すだけでなく、神経原性遺伝子座ノッチホモログタンパク質1(NOTCH-1)およびSRY-box転写因子9(SOX-9)の発現の増加を示すことが報告されています12,13,14,15。軟骨および半月板の両方からCPCを単離する2つの標準的な方法があり、そのうちの1つはフィブロネクチン接着アッセイを通じて単離されたインテグリン受容体(CD49e / CD29)の発現に基づくもの - フィブロネクチン接着アッセイ由来軟骨形成体(FAA-CP)、もう1つは軟骨外植片からのそれらの高い移動能に基づくもの - 移動性軟骨形成体(MCP)11,13,16,17、18、19。数多くのin vitro研究は、軟骨細胞および骨髄(BM)-MSCsと比較して、FAA-CPCおよびMCPの両方の軟骨形成の優位性および肥大の減少を実証している20,21,22,23。

FAA-CPCとMCPを比較した最近のin vitro研究は、正常な酸素条件下での後者の祖先集団の軟骨再生能力の向上を実証している24。これらの楽観的なin vitroの結果は、硝子体様の再生を示しており、さらなるin vivo実験を後押ししています。それにもかかわらず、CPCの両方の集団は、動物モデル25,26,27,28,29のOAおよび他の骨軟骨障害の軟骨を効率的に修復および再生することが報告されています。

当研究室では、CPC単離技術の標準化や、その表現型特性を軟骨細胞やMSCとの比較に積極的に貢献してきました。この記事では、軟骨常在細胞、すなわち軟骨細胞、FAA-CPC、およびMCPの単離と培養に関与する手順を説明する詳細なプロトコルを提供します。

プロトコル

このプロトコルは承認されており、治験審査委員会(研究倫理委員会)の適切な規制とガイドラインに準拠しています。書面によるインフォームド コンセントを取得した後、ヒト脛骨大腿関節は、治療の一環として人工膝関節全置換術を必要とする変形性関節症 (OA) 患者 (Kellgren-Lawrence 放射線スコア 4)30 から調達されます。腫瘍、感染症、または炎症性関節炎(関節リウマチや痛風など)の徴候がある患者の関節は、研究から除外されました。すべての手順は無菌条件下で実施され、実験プロセス全体を通じて標準的な実験室プロトコルに準拠していることが保証されています。

1. 脛骨大腿関節の入手

  1. 膝関節 (脛骨大腿関節) 治療の一環として膝上切断を必要とする人間のドナー、またはグレード IV の変形性関節症30 (軟骨硬化症による関節腔の著しい縮小を示す放射線学的証拠) の患者から膝関節 (脛骨大腿関節) を取得します。
    注:ヘルシンキ宣言の原則に従って、患者からインフォームドコンセントが得られることを確認してください。倫理委員会および治験審査委員会の規則の遵守を確保します。
  2. 感染症や炎症の症状を示す関節は除外します。

2.収穫したジョイントの処理

  1. 採取した脛骨大腿関節を無菌条件下で1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入れます。
  2. 滅菌アンダーパッドを配置して、ボンネットの下に滅菌領域を準備します。採取したジョイントをアンダーパッドに移します。
  3. 軟骨を上向きにして軟骨下骨を保持することにより、切片化された脛骨大腿関節を安定させます。
  4. メスの刃(No.22)を使用して、関節を取得してから1〜2時間以内に、変形性関節患者の非体重負荷領域から長方形の軟骨削片を採取します。
  5. 表層から深層まで8mm×10mmの軟骨部分を採取します。
  6. 軟骨スライスを1x PBS溶液で洗浄し、1〜2 mLのプレーンDMEM培地を含むシャーレに入れます。
  7. 軟骨をメスの刃(No.22)で1mm×1mm×1mm以下のサイズにきれいにスライスします。
    注意: 軟骨スライスまたはミンチ軟骨が乾かないようにしてください。それらを血清を含まない培地またはPBSに入れます。

3. 軟骨細胞の単離

  1. 刻んだ軟骨を、10 mLのDulbecco's Modified Eagle Medium F12(DMEM-F12)と0.15%コラゲナーゼII型を含む直立したT-25フラスコに入れて酵素消化します。.フラスコをCO2 インキュベーターで12〜14時間放置し、標準的な培養条件を確保します31。
    注:血清は酵素作用を不活性化するため、血清の痕跡を含まないプレーンなDMEM-F12培地を使用する必要があります。
  2. 一晩消化した後、放出された細胞を含む培地を、等量のDMEM-F12 + 10%ウシ胎児血清(FBS)が入った新鮮な無菌遠心チューブに移し、細胞ストレーナーを使用して細胞を破片から分離します。放出された細胞は「軟骨細胞」です。
  3. ろ過した細胞を1200 x g の速度で37°Cで5分間遠心分離します。
  4. ペレットを乱さずに上清を捨てます。得られたペレットを1 mLの培地に再構成し、トリパンブルー排除アッセイを使用して放出された生細胞をカウントします。
  5. 軟骨細胞を10,000細胞/cm²の濃度のT-25フラスコにロードし、10% FBSを含むDMEM-F12を使用して必要な継代数まで拡大します。培地中のその他の成分には、アスコルビン酸(62 μg/mL)、L-グルタミン(2.5 mM/L)、ペニシリン-ストレプトマイシン(100 IU/mL)、およびアンホテリシン-B(2 μg/mL)が含まれます。
  6. 培地を3日ごとにリフレッシュし、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む0.125%トリプシンを使用してサブコンフルエンスで細胞を回収します。

4. フィブロネクチン接着アッセイ由来軟骨形成剤(FAA-CP)の単離

  1. 軟骨細胞の放出の12時間前に、1 mMのMgCl2 (10 μL)と1 mMのCaCl2 (10 μL)を含む1x PBSを10 mL、および100 μLのフィブロネクチン(10 μL / mL)を調製します32。
  2. 調製した溶液を使用して、6ウェルプレート(1.5 mL/9.3 cm2)の必要な数のウェルをコーティングします。
  3. プレートをしっかりと密封し、4°Cで一晩冷蔵します。
  4. さらに、軟骨細胞の単離について説明したのと同様の方法で軟骨の削りくずを取得します(ステップ2.1-2.5)。
  5. 軟骨の削りくずを、個々の軟骨細胞を得るために37°Cに維持された振とう水浴中で、一晩中連続して酵素消化(0.2%プロナーゼを3時間、続いて0.04%コラゲナーゼII型を12時間)にさらします。
  6. 翌日、フィブロネクチンでコーティングされた6ウェルプレートを冷蔵庫から取り出し、余分なフィブロネクチンを取り除きます。
    注:余分なフィブロネクチンは、ウェルの底のコーティングを乱さずにゆっくりと穏やかに除去する必要があります。MgCl2 (10 μL)と1 mMのCaCl2 の存在は、細胞の接着を確実にするために重要です。
  7. 2〜3 mLのプレーンDMEM-F12培地をコーティングウェルに加えます。
  8. 放出された軟骨細胞を4000細胞/ウェルの負荷密度でコーティングされたウェルに播種し、プレートを20分間乱さずに放置します。
  9. インキュベーション後、余分な培地と非接着性細胞を除去します。軟骨細胞(DMEM-F12 + 10% FBS)に使用した標準増殖培地を2〜3 mL追加します。
  10. 接着細胞を標準培養条件下で10〜12日間維持し、CPCクローン(>32細胞のコロニー)を取得します。
  11. 0.125%トリプシン-EDTAを使用して180秒間単離し、クローンを1クローン/5cm²の比率で再播種し、濃縮ポリクローナルCPを必要な合流点まで拡大します。得られたこれらの細胞は「FAA-CPC」と呼ばれます。
  12. DMEM-F12培地+10%FBS+トランスフォーミング増殖因子β2(TGFβ2:1ng/mL)+線維芽細胞増殖因子(FGF2:5ng/mL)で細胞をさらに培養します。
    注:フィブロネクチン被覆プレート上の細胞のインキュベーションは、軟骨細胞も付着し始める可能性があるため、20分を超えてはなりません。20分間の接着期間中、培地には血清が含まれていてはなりません。次に、フォームクローンに付着する細胞を、FBSを追加で含む培地で培養する必要があります。クローンは、各クローンが32個を超えるセルを持つことを確認した後にのみ分離する必要があります。これは、トランジットアンプを避けるためです。トリプシン化後のクローンのさらなる拡大には、言及された追加の成長因子が含まれるべきである。フィブロネクチンコーティングプレートの4000軟骨細胞/9.3 cm2 のローディング密度で、20分間のインキュベーションとそれに続く洗浄後、合計80〜100個の細胞が接着します。これらのうち、約20のクローンが成長に進み、10〜12日以内に5人の人口が倍増します。

5. 移動性軟骨形成動物の単離

  1. 採取した関節関節から軟骨外植片(10 mm x 5 mm x 1 mm)を剃り、10% FBSおよび10 mMグルタマックス(2-3 explants/well)33を含むDMEM-F12培地を含む滅菌6ウェルプレートに入れる。
  2. 外植片を載せたプレートを、37°Cに維持されたCO2 インキュベーターで48時間放置します。
  3. 2日後、外植片を10 mLの0.1%コラゲナーゼ溶液を含む遠心チューブに移し、酵素消化を行います。チューブを37°Cで2時間インキュベートします。
    注:外植片は、微量の血清が酵素作用を不活性化する可能性があるため、酵素消化前に1x PBSですすぐ必要があります。洗浄するには、2〜3mLの1x PBSを充填したシャーレに外植片を浸します。これは、放出された軟骨細胞との汚染を防ぐためでもあります。外植片の取り扱いは最小限に抑える必要があり、これは移動を開始した先駆者にストレスを与えないようにするためです。
  4. 消化後、外植片を1x PBSですすぎ、10%FBSと10 mMのグルタマックス培地を含む新鮮なDMEM-F12培地を含むプレートの同じウェルに戻します。
  5. プレートをインキュベーター内の標準的な培養条件に維持します。その後の数日間で軟骨形成体の移動を観察します。
  6. サブコンフルエンスに到達したら、EDTAを含むトリプシンの0.125%を使用してMCPを収穫します。
  7. 10% の FBS と 10 mM の Glutamax を含む DMEM-F12 を含む標準の膨張媒体を使用して MCP を展開します。

6. 軟骨細胞、FAA-CPおよびMCPの表現型特性評価

  1. フローサイトメトリー解析(FACS)
    注:採取した細胞群のFACS解析には、以下の手順を踏む必要があります。
    1. 0.125% トリプシンを使用して標準プロトコルに従って細胞をトリプシン化し、1200 x g、5 分間、室温で遠心分離して細胞ペレットを取得します。
    2. 上清を捨て、洗浄し、ペレットを1x PBSで再懸濁します。
    3. 懸濁液をFACS用のラベル付きチューブに移します。
    4. 懸濁液を2つのチューブに均等に分けます:コントロールとして機能する「未染色」チューブ(抗体を含まない細胞懸濁液)とテストとして機能する「染色された」チューブ(抗体を含む細胞懸濁液)。
    5. 染色用の個々の抗体/分化クラスター(CD)マーカーの技術データシートに従ってください。比較用の抗体には、CD105-FITC、CD73-PE、CD90-PE、CD106-APC(陽性発現マーカー)が含まれます。CD34-PE、CD45-FITC、およびCD14-FITC(陰性発現マーカー)34,35;CD166-BB515およびCD146-PE(潜在的軟骨形成マーカー)36,37.
      メモ: CD マーカーは感光性です。手順が暗闇で行われるようにするため。
    6. 細胞懸濁液を抗体と混合して暗所で30分間インキュベートします。
    7. 染色後、1 mLの1x PBSをチューブに加え、1200 x g、5分間、室温で遠心分離して細胞ペレットを得ます。
    8. 上澄みの4分の3を捨てます。穏やかなトリチュレーションにより、残りの上清内容物にペレットを再懸濁します。
    9. FACS解析に進みます。

7. qRT-PCR検査

注:遺伝子発現のqRT-PCR解析には、肥大型発現のためのI型コラーゲン(COL1A1)、X型コラーゲン(COL10A1)、およびラント関連転写因子(RUNX2)、および軟骨新生のためのSOX-9、アグリカン(ACAN)、およびII型コラーゲン(COL2A1)の評価が含まれます。

  1. 製造元の指示に従って、市販のキットを使用して細胞群からRNAを抽出します。
  2. 抽出後、A260/A280 比とRNA濃度を評価します。
  3. 抽出した280 ngのRNAを利用して、相補的DNA(cDNA)を構築します。
  4. Sybr Greenを使用してqRT-PCRを開始し、各反応にはサーモサイクラー上の最終濃度7 ngのcDNAが含まれています。
  5. 各遺伝子の相対的なmRNA発現をGAPDH参照ハウスキーピング遺伝子(ΔCt)に正規化します。
  6. 各個々の遺伝子のΔCt値をFAA-CPs(ΔΔCt)37の値と比較することにより、2-ΔΔCt法を使用して各遺伝子の相対発現を計算する。

8.多系統の差別化

注:市販の鑑別培地は、脂肪原性、骨原性、および軟骨原性の系統への三系統分化を誘導します。

  1. 脂肪分化のためには、細胞培養プレート内で負荷密度1000細胞/cm2 の細胞を播種し、脂肪分化培地を用いて(培地交換 - 3日に1回)80%のサブコンフルエンスまで3週間培養する。
  2. 骨形成性および軟骨形成性の分化については、28日間のペレット培養システム38に従ってください。
  3. 0.5 x 106 細胞を400 x g で12分間、37°Cで遠心分離してペレットを形成し、骨形成および軟骨形成分化培地を用いて分化を開始します。
  4. ペレットを固定し、包埋し、切片化して確認染色します(ステップ9)。

9. 確認染色

  1. 脂肪原性系統細胞の場合は、緩衝ホルマリンで細胞を固定し、洗浄し、オイルレッドO(0.5%)で染色します。コントロール(10% FBSを含む標準的なDMEM培地で培養)も染色します。
  2. 顕微鏡で観察し、画像を取得します。
  3. 分化した骨形成系譜細胞については、Alizarin Red(2%)で染色します。
    注:軟骨原性分化細胞には、複数の確認染色プロトコルが適用されます。
  4. アルシアンブルー染色:固定細胞をアルシアンブルーで5分間染色し、ニュートラルレッドで対比染色します。
  5. グリコサミノグリカン(GAG)含有量を評価するには、サフラニンO染色を実施します:スライドをウィーガート鉄ヘマトキシリンで染色し、続いて酸性アルコール(1%)、ファストグリーン溶液(0.05%)、酢酸(1%)、およびサフラニンO溶液(1%)でインキュベートします。
  6. トルイジンブルー染色:スライドをトルイジンブルー(0.1%)で5分間染色します。
  7. PicroSirius Red染色:スライドをPicrosirius Red(0.1%)で染色し、ヘマトキシリン色素を使用して対比染色します。
    注:染色後、グレードアルコールを使用してスライドを脱水し、キシレンを使用して透明にします。ジブチルフタル酸ポリスチレンキシレン(DPX)マウンタンタントを使用してスライドをマウントし、顕微鏡で観察し、画像を取得します。
  8. 軟骨原性分化ペレットの免疫組織化学染色(II型コラーゲン)染色では、プロナーゼ酵素(1 mg/mL)およびヒアルロニダーゼ酵素(2.5 mg/mL)を用いて、ペレット切片を酵素抗原賦活化にかけます。
  9. 切片を一次マウスモノクローナル抗コラーゲンII型抗体とインキュベートし、続いて1:250の二次HRP標識ヤギ抗マウス抗体とインキュベートします。
  10. スライドを3,3′-ジアミノベンジジン(DAB)色素で染色し、ヘマトキシリンを使用して対比染色します。
  11. 顕微鏡で観察し、画像を撮影します。

10. GAG/DNA含量の測定

  1. 軟骨原性分化ペレットをパパイン-システイン溶液を用いて65°Cで16時間消化します。
  2. Picrogreen試薬38 を用いてDNA濃度を推定し、ELISAプレートリーダーを用いて励起波長480nm、発光波長520nmでの蛍光強度を取得する。
  3. ジメチルメチレンブルー染料法38を用いて総GAG含有量を評価する。
  4. ELISAプレートリーダーを使用して、525 nmの光学密度を測定します。
  5. GAG 値を DNA 値に正規化し、GAG/DNA 比の合計を計算します。

結果

86.9mgの軟骨スライスから、1.72×105 細胞の軟骨細胞収量が認められた。ロードすると、軟骨細胞はすぐに付着し、最初は丸みを帯びた丸石の外観を示し、さらに拡大すると線維芽細胞状態に変化します(図1 A、B)。これらの軟骨細胞をフィブロネクチンプレートに播種すると、通常、2%の接着が得られ、各細胞はクローン増殖?...

ディスカッション

硝子組織を含む関節軟骨の潜在的な再生は、その2つの天然細胞タイプ、すなわち軟骨細胞と軟骨形成細胞の最適化によって達成できる可能性があります。軟骨細胞に関する広範な研究は、軟骨修復における軟骨細胞の役割について貴重な洞察を提供してきましたが、再生組織の性質に関する疑問は、軟骨の表現型を強化し、代替療法を模索する取り組みを促してい?...

開示事項

何一つ。

謝辞

Bhavini Krishnan氏とMerin Mary Zachariah氏には知的意見をいただき、Centre for Stem Cell Research(inStem Bengaluruの一部門)、生理学部、クリスチャン医科大学、ヴェールール、インフラ支援に感謝いたします。進行中のプロジェクトは、バイオテクノロジー省(BT/PR32777/MED/31/415/2019)、インド政府、科学工学研究委員会(CRG/2022/004277)、インド政府、およびヴェールールのクリスチャン医科大学の流体研究助成金によってサポートされています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
22-scalpel blade GLASS VAN
6-well plate CORNING3516
Alcian BlueTHERMO SCIENTIFICJ6012
Alizarin Red SIGMA130223
Amphotericin-B (2 μg/mL).GIBCO15240062
Ascorbic acid (62 μg/mL)SIGMA ALDRICHA4544-25G
BC CytoFLEX LX flow cytometer BECKMAN COULTERCYTExpert Software Version 2.5
CaCl2SIGMA ALDRICH C34006
CD105-FITCBD BIOSCIENCE561443
CD106-APCBD BIOSCIENCE551147
CD14-FITCBD BIOSCIENCE555397
CD29-APCBD BIOSCIENCE559883
CD34-PEBD BIOSCIENCE348057
CD45-FITCBD BIOSCIENCE347463
CD49b-FITCMILTENYL BIOTEC MACS 130/100337
CD49e-PEBD BIOSCIENCE555617
CD73-PEBD BIOSCIENCE550257
CD90-PEBD BIOSCIENCE561970
Cell counterDE NOVIXCell Drop BF
Cell strainerHIMEDIATCP024
CentrifugeBECKMAN COULTERAllegra X-30R
CO2 incubator THERMO SCIENTIFICMODEL-371
Collagen type X (COL10A1),Runt-related transcription factor (RUNX2),SRY-Box Transcription Factor 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN), and Collagen type II (COL2A1) EUROGENTEC, BELGIUM
Collagenase type IIWORTHINGTONLS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)SIGMA ALDRICHD8900-1L
ELISA plate readerMOLECULAR DEVICESSpectraMax i3x Reader
Fast GreenFISHER SIENTIFIC2353459
Fetal Bovine SerumGIBCO10270106
FGF2CLOUD CLONE CORPAPA551Hu01
Fibronectin (10 µL/mL)SIGMA ALDRICHF1141
First-Strand synthesis systemTAKARA BIO6110A
GlutamaxGIBCO35050061
HematoxylinQUALIGENSQ39411
MgCl2 SIGMA ALDRICHM8787
Oil Red OSIGMA1320065
PBS (Phosphate Buffered Saline)GIBCO10010023
PCR thermocycler APPLIED BIOSYSTEMSQuantstudio 12K Flex thermocycler 
Penicillin-streptomycin (100 IU/mL)GIBCO15240062
Picrosirius RedALFA AESAR2610108
Primary antibody (mouse Collagen type II)DSHBDSHB II II6B3
PronaseROCHE10165913103
Quant-iT Picogreen dsDNA reagentTHERMO SCIENTIFICP7589
RefrigeratorELANPRO
RNeasy MiniKitQIAGEN74104
Safranin OQUALIGENSQ39962
Secondary antibody (Goat Anti-Mouse IgG Antibody, HRP conjugate)THERMO SCIENTIFIC31430
Shaking water bath REMI
StemPro differentiating kits GIBCO1007201, A1007001, and A1007101
T-25 flask CORNING430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blue EUROGENTECUF-LSMT-B0701
TGFβABCAMab277760
Tissue Culture PetridishTARSONS960010
Toluidine BlueQUALIGENS2040
Tryphan blue GIBCO15250061
Trypsin EDTAGIBCO25200072

参考文献

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