使用纤连蛋白粘附和迁移测定分离软骨细胞和软骨生成器

摘要

该方案详细介绍了从人关节软骨中分离软骨细胞、纤连蛋白粘附测定衍生的软骨形成剂 （FAA-CPs） 和迁移性软骨形成剂 （MCP）。它涵盖了酶消化、纤连蛋白粘附和基于迁移的分析，用于分离和表征这些细胞。

摘要

软骨生成细胞 （CPC） 最近被确定为一个独特的亚群，由于其间充质特性、增强的软骨生成和有限的肥大性状而显示出前景。祖细胞的富集是通过差异纤连蛋白粘附和基于迁移的外植体测定实现的，与软骨细胞相比，纤连蛋白粘附测定衍生的软骨形成剂 （FAA-CPs） 和迁移性软骨形成剂 （MCP） 显示出卓越的潜力。本文深入探讨了分离常驻软骨衍生细胞（即软骨细胞和软骨生成细胞）的细节。虽然来自软骨细胞研究的宝贵见解有助于我们理解软骨修复，但正在进行的努力正朝着使用软骨生成剂和探索它们作为替代治疗方法的潜力。此外，该方法文章提供了从软骨中分离三种特定细胞类型的详细分步方案：软骨细胞、FAA-CP 和 MCP。通过遵循标准化程序，该方案有助于成功提取这些细胞亚型。本文以广泛的研究为基础，重点介绍了用于分离不同亚群的复杂技术，以及扩增和维持其培养物所需的优化培养条件。该方法包括人关节软骨来源的软骨细胞的酶分离、连续酶消化后的纤连蛋白粘附差异以及基于迁移的外植体测定以获得软骨驻留细胞。

引言

基于细胞的再生疗法的出现代表了治疗软骨相关疾病的重要方法，例如骨关节炎 （OA） 和软骨缺损¹。这些疾病的特点是关节内软骨的破裂或损伤，在治疗过程中带来了巨大的挑战。据报道，由于其无神经结构、无血管性和低有丝分裂活性，关节软骨的自我修复受到限制²。

用于软骨组织再生的最常用细胞是间充质干细胞 （MSC） 和软骨细胞³。然而，一些研究报告了使用这些细胞进行再生的局限性⁴。这些限制包括在延长体外扩增过程中软骨细胞的末端分化以达到所需的细胞计数和 MSC 的肥大倾向。这些因素会导致纤维软骨和透明结构的次优组合形成修复组织 5,6,7,8。

软骨形成细胞 （CPC） 的发现源于在关节软骨中寻找替代细胞⁹。由于它们与 MSC 的相似性和卓越的软骨生成潜力，它们引起了极大的兴趣，同时表现出减少的肥大 - 这是人们寻求的不可或缺的组合^10,11。据报道，与软骨细胞相比，这些祖细胞群表现出增强的复制和端粒酶活性，以及神经源性基因座缺口同源物 1 （NOTCH-1） 和 SRY 盒转录因子 9 （SOX-9） 的表达增加12,13,14,15。有两种标准方法可以从软骨和半月板中分离 CPC，其中一种基于其整合素受体 （CD49e/CD29） 表达，通过纤连蛋白粘附测定分离 - 纤连蛋白粘附测定衍生的软骨生成器 （FAA-CPs），另一种基于它们从软骨外植体中迁移潜力增强 - 迁移性软骨生成器 （MCP）11,13,16,17，^18,19.大量体外研究表明，与软骨细胞和骨髓 （BM）-MSC 相比，FAA-CPC 和 MCP 的软骨形成优势和肥大减少 20,21,22,23。

最近将 FAA-CPC 与 MCP 进行比较的体外研究表明，在正常氧气条件下，后者祖细胞群的软骨再生能力增强²⁴。这些乐观的体外结果展示了类似透明素的再生，鼓励进一步的体内实验。然而，据报道，在动物模型中，这两个 CPC 种群都能有效地修复和再生 OA 和其他骨软骨疾病中的软骨 25,26,27,28,29。

我们的实验室积极促进了 CPC 分离技术的标准化，并将其表型特征与软骨细胞和 MSC 进行比较。本文将提供详细的方案，解释分离和培养软骨驻留细胞（即软骨细胞、FAA-CPC 和 MCP）所涉及的步骤。

研究方案

该协议已获得批准，并符合机构审查委员会（研究和伦理委员会）的相应法规和指南。在获得书面知情同意后，从需要全膝关节置换术作为治疗一部分的骨关节炎 （OA） 患者 （Kellgren-Lawrence 放射学评分 4）³⁰ 购买人类胫股关节。具有任何肿瘤、感染或炎症性关节炎 （如类风湿性关节炎或痛风） 体征的患者的关节被排除在研究之外。确保所有程序都在无菌条件下进行，并在整个实验过程中遵守标准实验室方案。

1. 获取胫股关节

1. 从需要膝上截肢作为治疗一部分的人类供体或接受全膝关节置换术的 IV 级骨关节炎³⁰ （放射学证据显示关节间隙明显减少伴软骨硬化）的人那里获得膝关节（胫股关节）。
   注意：确保按照赫尔辛基宣言的原则获得患者的知情同意。确保遵守道德委员会和机构审查委员会规则。
2. 排除任何出现感染或炎症症状的关节。

2. 加工收获的关节

1. 在无菌条件下，将收获的胫股关节置于 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液中。
2. 通过放置无菌底垫，在引擎盖下准备一个无菌区域。将收获的关节转移到底垫上。
3. 通过握住软骨下骨，使软骨朝上来稳定切片的胫股关节。
4. 使用手术刀刀片（22 号），在获得关节后 1-2 小时内从 OA 患者的非承重区域收获矩形软骨屑。
5. 从浅层到深层收获 8 毫米 x 10 毫米的软骨切片。
6. 用 1x PBS 溶液清洗软骨片，并将它们放入含有 1-2 mL 普通 DMEM 培养基的培养皿中。
7. 用手术刀刀片（22 号）将软骨片切成小于 1 毫米 x 1 毫米 x 1 毫米的尺寸。
   注意：确保软骨片或碎软骨不会变干;将它们置于不含血清的培养基或 PBS 中。

3. 软骨细胞的分离

1. 将切碎的软骨放入一个直立的 T-25 培养瓶中，该培养瓶含有 10 mL Dulbecco's 改良 Eagle 培养基 F12 （DMEM-F12），含 0.15% II 型胶原酶，用于酶消化。将培养瓶在 CO₂ 培养箱中不受干扰 12-14 小时，确保标准培养条件³¹。
   注：应使用不含微量血清的普通 DMEM-F12 培养基，因为血清会使酶作用失活。
2. 过夜消化后，将含有释放细胞的培养基转移到含有等体积 DMEM-F12 + 10% 胎牛血清 （FBS） 的新鲜无菌离心管中，使用细胞过滤器将细胞与碎片分离。释放的细胞是“软骨细胞”。
3. 将过滤后的细胞在 37 °C 下以 1200 x g 的速度离心 5 分钟。
4. 弃去上清液，不要干扰沉淀。在 1 mL 培养基中复溶获得的沉淀，并使用台盼蓝排阻测定法对释放的活细胞进行计数。
5. 将软骨细胞以 10,000 个细胞/cm² 的浓度加载到 T-25 培养瓶中，并使用含有 10% FBS 的 DMEM-F12 扩增至所需的传代次数。培养基中的其他成分包括抗坏血酸 （62 μg/mL）、L-谷氨酰胺 （2.5 mM/L）、青霉素-链霉素 （100 IU/mL） 和两性霉素-B （2 μg/mL）。
6. 每 3 天刷新一次培养基，并使用含有乙二胺四乙酸 （EDTA） 的 0.125% 胰蛋白酶在亚汇合处收获细胞。

4. 纤连蛋白粘附试验衍生的软骨形成剂 （FAA-CPs） 的分离

1. 在软骨细胞释放前 12 小时，制备 10 mL 1x PBS，其中含有 1 mM MgCl₂ （10 μL） 和 1 mM CaCl₂ （10 μL） 和 100 μL 纤连蛋白 （10 μL/mL）³²。
2. 使用制备的溶液包被所需数量的 6 孔板 （1.5 mL/9.3 cm²）。
3. 密封板并在 4 °C 下冷藏过夜。
4. 此外，以类似于分离软骨细胞的方式获取软骨屑（步骤 2.1-2.5）。
5. 将软骨屑在维持在 37 °C 的振荡水浴中连续进行过夜酶消化（0.2% 链霉蛋白酶 3 小时;然后 0.04% II 型胶原酶 12 小时），以获得单个软骨细胞。
6. 第二天，从冰箱中取出纤连蛋白包被的 6 孔板，并去除过量的纤连蛋白。
   注意：应缓慢而温和地去除过量的纤连蛋白，不要干扰孔底的涂层。MgCl₂ （10 μL） 和 1 mM CaCl₂ 的存在对于确保细胞附着至关重要。
7. 将 2-3 mL 普通 DMEM-F12 培养基加入包被的孔中。
8. 将释放的软骨细胞以 4000 个细胞/孔的加载密度接种到包被的孔上，并保持板 20 分钟不受干扰。
9. 孵育后，去除多余的培养基和非贴壁细胞。添加 2-3 mL 用于软骨细胞的标准生长培养基 （DMEM-F12 + 10% FBS）。
10. 将贴壁细胞在标准培养条件下维持 10-12 天，以获得 CPC 克隆（>32 个细胞的集落）。
11. 使用 0.125% 胰蛋白酶-EDTA 分离 180 秒，以 1 个克隆/5 cm² 的比例重新铺板克隆，并将富集的多克隆 CP 扩增至所需的汇合度。获得的这些信元称为“FAA-CPC”。
12. 在 DMEM-F12 培养基 + 10% FBS + 转化生长因子 β 2 （TGFβ2： 1 ng/mL） + 成纤维细胞生长因子 （FGF2： 5 ng/mL） 中进一步培养细胞。
    注：细胞在纤连蛋白包被板上的孵育不应超过 20 分钟，因为软骨细胞也可能开始粘附。在 20 分钟的粘附期内，培养基必须不含血清。接下来，粘附在形成克隆的细胞必须在另外含有 FBS 的培养基中培养。只有在确保每个克隆具有 32 个以上的细胞后，才能分离克隆;这是为了避免使用传输放大器。胰蛋白酶消化后克隆的进一步扩增应包括上述其他生长因子。孵育 20 分钟后洗涤后，负载密度为 4000 个软骨细胞/9.3 cm² 纤连蛋白包被板，总共粘附 80-100 个细胞。其中，大约 20 个克隆将发展壮大，并在 10-12 天内实现 5 个种群翻倍。

5. 分离迁移性软骨生成器

1. 从收获的关节节中剃除软骨外植体 （10 mm x 5 mm x 1 mm），并将它们置于含有 10% FBS 和 10 mM Glutamax（2-3 个外植体/孔）的 DMEM-F12 培养基的无菌 6 孔板中³³。
2. 将外植体的板在维持在 37 °C 的 CO₂ 培养箱中保持 48 小时。
3. 2 天后，将外植体转移到含有 10 mL 0.1% 胶原酶溶液的离心管中，用于酶消化。将试管在 37 °C 下孵育 2 小时。
   注意：在酶消化之前，需要用 1x PBS 冲洗外植体，因为微量血清会使酶的作用失活。洗涤时，将外植体浸入装有 2-3 mL 1x PBS 的培养皿中;这也是为了确保不受任何释放的软骨细胞的污染。外植体的处理必须保持在最低限度，这是为了避免对已经开始迁移的祖细胞造成压力。
4. 消化后，用 1x PBS 冲洗外植体，并将它们放回含有 10% FBS 和 10 mM Glutamax 培养基的新鲜 DMEM-F12 培养基的板的相同孔中。
5. 在培养箱中将板保持在标准培养条件下。观察随后几天软骨生殖器的迁移。
6. 到达亚汇合处后，使用 0.125% 含 EDTA 的胰蛋白酶收获 MCP。
7. 使用标准扩增培养基扩增 MCP，其中包括含有 10% FBS 和 10 mM Glutamax 的 DMEM-F12。

6. 软骨细胞、FAA-CPs 和 MCP 的表型特征

1. 流式细胞术分析 （FACS）
   注意：对收获的细胞组进行 FACS 分析时，请遵循以下步骤。
   1. 根据标准方案使用 0.125% 胰蛋白酶对细胞进行胰蛋白酶消化，并在室温下以 1200 x g 离心 5 分钟以获得细胞沉淀。
   2. 弃去上清液，洗涤并用 1x PBS 重悬沉淀。
   3. 将悬浮液转移到标记的试管中进行 FACS。
   4. 将悬浮液均匀分成两管：用作对照的“未染色”管（不含抗体的细胞悬液）和用作测试的“染色”管（含抗体的细胞悬液）。
   5. 按照单个抗体/分化簇 （CD） 标志物的技术数据表进行染色。用于比较的抗体包括 CD105-FITC、CD73-PE、CD90-PE、CD106-APC（阳性表达标志物）;CD34-PE、CD45-FITC 和 CD14-FITC（阴性表达标志物）^34,35;CD166-BB515 和 CD146-PE （潜在的软骨形成标志物）^36,37。
      注意：CD 标记是光敏的。确保这些步骤在黑暗中完成。
   6. 将细胞悬液与抗体在黑暗中孵育 30 分钟。
   7. 染色后，向试管中加入 1 mL 1x PBS，并在室温下以 1200 x g 离心 5 分钟以获得细胞沉淀。
   8. 弃去四分之三的上清液。通过轻轻研磨，将沉淀重悬于剩余的上清液内容物中。
   9. 继续进行 FACS 分析。

7. qRT-PCR

注：基因表达的 qRT-PCR 分析包括评估 I 型胶原蛋白 （COL1A1）、X 型胶原蛋白 （COL10A1） 和 Runt 相关转录因子 （RUNX2） 的肥大表达，以及 SOX-9、聚集蛋白聚糖 （ACAN） 和 II 型胶原蛋白 （COL2A1） 的软骨生成。

1. 按照制造商的说明，使用市售试剂盒从细胞组中提取 RNA。
2. 提取后，评估 A₂₆₀/A₂₈₀ 比率和 RNA 浓度。
3. 利用 280 ng 提取的 RNA 构建互补 DNA （cDNA）。
4. 使用 Sybr Green 启动 qRT-PCR，每个反应在热循环仪上含有终浓度为 7 ng 的 cDNA。
5. 将每个基因的相对 mRNA 表达标准化为 GAPDH 参考管家基因 （ΔCt）。
6. 通过将每个基因的 ΔCt 值与 FAA-CPs （ΔΔCt） 的 ΔCt 值进行比较，使用 ^2-ΔΔCt 技术计算每个基因的相对表达³⁷。

8. 多谱系分化

注：市售的差异培养基诱导三系分化为无脂细胞系、成骨细胞系和软骨细胞系。

1. 对于成脂分化，将细胞以 1000 个细胞/cm² 的负载密度接种在细胞培养板中，并使用成脂分化培养基（培养基更换 - 每 3 天一次）培养，直到 80% 的亚汇合，持续 3 周。
2. 对于成骨和成软骨分化，遵循 28 天沉淀培养系统³⁸。
3. 在 37 °C 下以 400 x g 离心 0.5 x 10⁶ 个细胞 12 分钟以形成沉淀并使用成骨和成软骨分化培养基开始分化。
4. 固定、包埋和切片沉淀以进行确认染色（步骤 9）。

9. 确认染色

1. 对于成脂谱系细胞，用缓冲福尔马林固定细胞，洗涤并用油红 O （0.5%） 染色。也对对照品进行染色（在含 10% FBS 的标准 DMEM 培养基上培养）。
2. 在显微镜下观察并获取图像。
3. 对于分化的成骨谱系细胞，用茜素红 （2%） 染色。
   注：多种确认染色方案适用于软骨形成分化细胞。
4. 阿尔新蓝染色：用阿尔新蓝对固定的细胞染色 5 分钟，然后用中性红复染。
5. 为了评估糖胺聚糖 （GAG） 含量，进行番红素 O 染色：用 Wiegert 苏木精铁对载玻片进行染色，然后与酸性醇 （1%）、固绿溶液 （0.05%）、乙酸 （1%） 和番红 O 溶液 （1%） 一起孵育。
6. 甲苯胺蓝染色：用甲苯胺蓝 （0.1%） 对载玻片染色 5 分钟。
7. PicroSirius Red 染色：用 Picrosirius Red （0.1%） 对载玻片进行染色，并使用苏木精染料进行复染。
   注：染色后，使用分级酒精对载玻片进行脱水，并使用二甲苯澄清。使用邻苯二甲酸二丁酯聚苯乙烯二甲苯 （DPX） 封片剂封片，在显微镜下观察并获取图像。
8. 对于软骨形成分化沉淀的免疫组织化学（II 型胶原蛋白）染色，使用链霉蛋白酶 （1 mg/mL） 和透明质酸酶 （2.5 mg/mL） 对沉淀切片进行酶促抗原修复。
9. 用一抗小鼠单克隆抗胶原 II 型抗体孵育切片，然后用 1：250 的二抗 HRP 标记的山羊抗小鼠抗体孵育。
10. 用 3,3′-二氨基联苯胺 （DAB） 显色剂对载玻片进行染色，并使用苏木精对它们进行复染。
11. 在显微镜下观察并捕获图像。

10. 测定 GAG/DNA 含量

1. 使用 papain-cysteine 溶液在 65 °C 下消化软骨形成分化的沉淀 16 小时。
2. 使用 Picrogreen 试剂³⁸ 估计 DNA 浓度，并使用 ELISA 读板器获取波长 - 激发：480 nm，发射：520 nm 的荧光强度。
3. 使用二甲基亚甲基蓝染料法³⁸ 评估总 GAG 含量。
4. 使用 ELISA 读板器测量 525 nm 处的光密度。
5. 将 GAG 值标准化为 DNA 值并计算总 GAG/DNA 比率。

结果

从 86.9 mg 软骨切片中，观察到软骨细胞产量为 1.72 x 10⁵ 个细胞。加载后，软骨细胞迅速粘附，呈现最初的圆形鹅卵石外观，并在进一步扩增时转变为成纤维细胞状态（图 1 A、B）。将这些软骨细胞接种到纤连蛋白板上通常会产生 2% 的粘附，每个细胞都经历克隆生长（图 2 C、D），到第 10-12 天达...

讨论

含有透明组织的关节软骨的潜在再生可以通过优化其两种天然细胞类型来实现：软骨细胞和软骨生成细胞。虽然对软骨细胞的广泛研究为它们在软骨修复中的作用提供了有价值的见解，但关于再生组织性质的问题促使人们努力增强其表型并探索替代疗法³。软骨发生素被确定为相对较新的细胞亚群，由于其固有的间充质特性、增强的软骨生成和有限的肥?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
22-scalpel blade	GLASS VAN
6-well plate	CORNING	3516
Alcian Blue	THERMO SCIENTIFIC	J6012
Alizarin Red	SIGMA	130223
Amphotericin-B (2 μg/mL).	GIBCO	15240062
Ascorbic acid (62 μg/mL)	SIGMA ALDRICH	A4544-25G
BC CytoFLEX LX flow cytometer	BECKMAN COULTER	CYTExpert Software Version 2.5
CaCl2	SIGMA ALDRICH	C34006
CD105-FITC	BD BIOSCIENCE	561443
CD106-APC	BD BIOSCIENCE	551147
CD14-FITC	BD BIOSCIENCE	555397
CD29-APC	BD BIOSCIENCE	559883
CD34-PE	BD BIOSCIENCE	348057
CD45-FITC	BD BIOSCIENCE	347463
CD49b-FITC	MILTENYL BIOTEC	MACS 130/100337
CD49e-PE	BD BIOSCIENCE	555617
CD73-PE	BD BIOSCIENCE	550257
CD90-PE	BD BIOSCIENCE	561970
Cell counter	DE NOVIX	Cell Drop BF
Cell strainer	HIMEDIA	TCP024
Centrifuge	BECKMAN COULTER	Allegra X-30R
CO2 incubator	THERMO SCIENTIFIC	MODEL-371
Collagen type X (COL10A1),Runt-related transcription factor (RUNX2),SRY-Box Transcription Factor 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN), and Collagen type II (COL2A1)	EUROGENTEC, BELGIUM
Collagenase type II	WORTHINGTON	LS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)	SIGMA ALDRICH	D8900-1L
ELISA plate reader	MOLECULAR DEVICES	SpectraMax i3x Reader
Fast Green	FISHER SIENTIFIC	2353459
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10270106
FGF2	CLOUD CLONE CORP	APA551Hu01
Fibronectin (10 µL/mL)	SIGMA ALDRICH	F1141
First-Strand synthesis system	TAKARA BIO	6110A
Glutamax	GIBCO	35050061
Hematoxylin	QUALIGENS	Q39411
MgCl2	SIGMA ALDRICH	M8787
Oil Red O	SIGMA	1320065
PBS (Phosphate Buffered Saline)	GIBCO	10010023
PCR thermocycler	APPLIED BIOSYSTEMS	Quantstudio 12K Flex thermocycler
Penicillin-streptomycin (100 IU/mL)	GIBCO	15240062
Picrosirius Red	ALFA AESAR	2610108
Primary antibody (mouse Collagen type II)	DSHB	DSHB II II6B3
Pronase	ROCHE	10165913103
Quant-iT Picogreen dsDNA reagent	THERMO SCIENTIFIC	P7589
Refrigerator	ELANPRO
RNeasy MiniKit	QIAGEN	74104
Safranin O	QUALIGENS	Q39962
Secondary antibody (Goat Anti-Mouse IgG Antibody, HRP conjugate)	THERMO SCIENTIFIC	31430
Shaking water bath	REMI
StemPro differentiating kits	GIBCO	1007201, A1007001, and A1007101
T-25 flask	CORNING	430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blue	EUROGENTEC	UF-LSMT-B0701
TGFβ	ABCAM	ab277760
Tissue Culture Petridish	TARSONS	960010
Toluidine Blue	QUALIGENS	2040
Tryphan blue	GIBCO	15250061
Trypsin EDTA	GIBCO	25200072