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要約

本研究では、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)と心筋梗塞(MI)の関係を共発現遺伝子により検討し、トロンボスポンジン1(THBS1)をバイオマーカーとして同定しました。免疫浸潤解析により、CD8+ T細胞と好中球が主要な因子であることが明らかになり、THBS1はNAFLDおよびMIの診断ツールとしての可能性を示しています。

要約

非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)と心筋梗塞(MI)は、有病率と死亡率が高い2つの主要な健康負担です。この研究は、NAFLDとMIの関係を理解し、バイオインフォマティクスと機械学習を使用してNAFLD関連のMIの潜在的な重要なバイオマーカーを特定するために、共発現遺伝子を探索することを目的としています。機能濃縮分析を行い、共タンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク図を作成し、サポートベクター機械再帰的特徴除去(SVM-RFE)および最小絶対収縮選択演算子(LASSO)技術を用いて、発現差のある遺伝子(DEG)であるトロンボスポンジン1(THBS1)を同定しました。THBS1は、NAFLD患者(AUC = 0.981)とMI患者(AUC = 0.900)の区別において強力なパフォーマンスを示しました。免疫浸潤解析により、NAFLDおよびMI患者ではCD8+ T細胞が有意に低く、好中球レベルが高いことが明らかになりました。CD8+ T細胞と好中球は、NAFLD/MIを健康な対照と区別するのに効果的でした。相関解析の結果、THBS1はNAFLDおよびMI患者において、CCR(ケモカイン受容体)、MHCクラス(主要組織適合遺伝子複合体クラス)、好中球、パラ炎症、およびTfh(濾胞性ヘルパーT細胞)と正の相関を示し、CD8+ T細胞、細胞溶解活性、およびTIL(腫瘍浸潤リンパ球)と負の相関を示しました。THBS1 は、健康な対照と比較して NAFLD/MI を診断するための新しいバイオマーカーとして浮上しました。この結果は、CD8+ T細胞と好中球が、NAFLD/MI患者と健常者を区別するための炎症性免疫機能として機能する可能性があることを示しています。

概要

非アルコール性脂肪肝疾患 (NAFLD) は、有病率が 25% から 30% の公衆衛生上の主要な問題です1。NAFLDは糖尿病患者の間で高い有病率であることが報告されています2。しかし、非糖尿病患者におけるNAFLDの重要性はまだ明らかではありません。研究によると、NAFLDはアテローム性動脈硬化症の病因において独立した役割を果たしていることが示唆されています3,4。さらに、メタアナリシスでは、NAFLD が冠動脈石灰化、内皮機能障害、およびアテローム性動脈硬化症と密接に関連しており、独立した心血管リスク因子5 として浮上していることが示されています。NAFLDと心血管疾患との関連については、まださらなる調査が必要です。

心筋梗塞(MI)は、世界中の患者とその家族に健康を脅かし、大きな経済的負担を強いる壊滅的な病気です6。MIは、NAFLD患者の主要な死因でもあります。British Medical Journalに掲載された臨床研究では、NAFLD患者の心筋梗塞のリスクは、非NAFLD患者の1.17倍であることが示されています7,8。いくつかの研究では、炎症、酸化ストレス、脂質代謝など、NAFLD関連のMI9,10,11に寄与する分子経路が特定されています。しかし、NAFLDとMIを結びつける根本的なメカニズムは不明のままです。NAFLDおよびMIの予後に関連する新規バイオマーカーを特定することは非常に重要です。

NAFLDの有病率の増加は、人口の広範なセグメントに影響を及ぼし、特に糖尿病との関連を考えると、重大な公衆衛生問題を強調しています。しかし、NAFLDが非糖尿病患者に与える影響については、まだ十分に理解されていません。NAFLDはアテローム性動脈硬化症の病因に関与しており、冠動脈石灰化、内皮機能障害、およびアテローム性動脈硬化症と密接に関連している独立した心血管危険因子として認識されています。このような関連性があるにもかかわらず、NAFLDと心筋梗塞(MI)などの心血管疾患を橋渡しする精密なメカニズムについては、さらなる解明が必要です。心筋梗塞は、世界の主要な死亡原因の1つであり、大きな経済的負担を強いています。NAFLD患者のMIのリスクは、NAFLDのない患者よりも著しく高く、これらの状態をつなぐ分子経路をより深く理解する必要性が浮き彫りになっています。炎症、酸化ストレス、脂質代謝が要因として示唆されていますが、正確なメカニズムは不明のままです。NAFLD関連心筋梗塞の予後と管理に関する洞察を提供できる新規バイオマーカーの特定が急務です。

そこで、本研究では、NAFLDとMIの間の差次的に発現する遺伝子(DEG)の相互作用を同定・解析するために、国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information-Gene Expression Omnibus, Table of Materials)からNAFLDおよびMIのRNAマイクロアレイデータセットをダウンロードしました。エンリッチメント解析、タンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク図の構築、サポートベクター機械再帰的特徴除去(SVM-RFE)、 および最小絶対収縮選択演算子(LASSO)アルゴリズムを使用して、ハブ遺伝子12,13,14,15,16,17,18,19を同定した。免疫浸潤解析を行い、NAFLDおよびMI患者の免疫細胞を調べました。最終的に、これらの方法を統合してNAFLDとMIの関係を解明しました。図1は、この研究で従った設計シーケンスを示しています。本研究では、バイオインフォマティクス、機械学習、免疫浸潤解析を組み合わせることで、新たな医療意思決定支援プラットフォームの開発に貢献することを目指しています。

この記事の主な貢献は、(1)共発現遺伝子の同定:この研究では、共発現遺伝子を特定することにより、NAFLDとMIの関係を強調し、これら2つの状態間の分子的リンクをより深く理解することができます。(2)バイオインフォマティクスと機械学習の応用:本研究では、サポートベクターの機械再帰的特徴除去(SVM-RFE)17 や最小絶対収縮選択演算子(LASSO)19などのバイオインフォマティクスと機械学習技術を用いて、THBS1を差次的に発現する遺伝子として同定しました。THBS1は、NAFLDおよびMI患者を健康な対照者と区別する上で高い性能を示しています。(3)免疫浸潤分析:この研究では、免疫浸潤分析を実施し、NAFLDおよびMI患者におけるCD8 + T細胞のレベルが有意に低く、好中球のレベルが高いことを明らかにします。 (4)相関分析:この研究では、THBS1がCCR(ケモカイン受容体)、MHCクラスI(主要組織適合遺伝子複合体クラスI)、好中球、 パラ炎症、およびTfh(濾胞性ヘルパーT)細胞。CD8+ T細胞、細胞溶解活性、および腫瘍浸潤リンパ球(TIL)と負の相関があります。

プロトコル

使用したデータベース、ウェブリンク、ソフトウェア/パッケージの詳細は、 資料表に記載されています。使用するシミュレーションパラメータを 表1に示します。

1. RNAマイクロアレイデータセットの取得

  1. NCBI-GEOデータベースから心筋梗塞(MI)データセットGSE66360をダウンロードします。
  2. NCBI-GEOデータベースから非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)データセットGSE89632をダウンロードします。
  3. ダウンロードしたデータセットに、49 個の MI サンプル、GSE66360 個の 50 個の正常なコントロール、39 個の NAFLD サンプル、および GSE89632 個の 24 個の正常なコントロールが含まれていることを確認します。

2. DEGの同定

  1. データの前処理とDEGの識別
    1. 適切な R 関数を使用して、データセットを RStudio に読み込みます。
    2. R パッケージ limma を使用して、しきい値 P < 0.05P および | log FC | > 1.5 の DEG12 を特定します。
    3. R パッケージの pheatmap、 ggplot2、 および Venn を使用して、DEG を視覚化するためのヒートマップとベン図を生成します。
  2. ビジュアライゼーションの作成
    1. pheatmap を使用して DEG のヒートマップを生成します。
    2. ggplot2 を使用して、NAFLD と MI の間の DEG のオーバーラップを示すベン図を作成します。

3. 濃縮分析

  1. GO、KEGG、およびDOエンリッチメント分析の実行
    1. DEG を R パッケージ clusterProfiler13 に読み込みます。
    2. Gene Ontology(GO)エンリッチメント解析を実施し、DEGを分子機能、生物学的プロセス、および細胞成分に分類します。
    3. 京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)の経路解析を行い、DEGを生化学的経路にマッピングします。
    4. Disease Ontology(DO)エンリッチメント解析を使用して、DEGを特定の臨床状態に関連付けます。

4. PPIネットワークの構築によるPPI分析

  1. STRINGオンラインプラットフォーム14を使用して、信頼スコア0.4のco-DEGのタンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク図を作成します。
  2. Cytoscape15を使用してPPIネットワークを可視化します。

5. 機械学習アルゴリズムを応用した候補ハブDEGsスクリーニング

  1. RStudio で SVM-RFE (Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination) と LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) 回帰アルゴリズムを使用して、最も関連性の高い DEG16、17、18 を選択します。
  2. SVM-RFE がフィーチャを反復的にランク付けおよび削除し、LASSO回帰19 が正則化を適用して DEG のスパース セットを識別することを確認します。

6. 診断性能を評価するためのROC曲線の構築

  1. RStudioを使用して、ROC(Receiver Operating Characteristic)曲線解析20を実行します。
  2. 重要なco-DEGの曲線下面積(AUC)を計算します。

7. 免疫浸潤を探求するための免疫浸潤解析

  1. Rパッケージ GSVA および GSEABase を使用して単一サンプルのGene Set Enrichment Analysis(ssGSEA)を実行し、NAFLDおよびMI21の免疫浸潤を解析します。
  2. NAFLDサンプルとMIサンプル、および健康なコントロールとの間の免疫細胞タイプの相対存在量を比較します。

8. 統計分析

  1. すべての統計分析を RStudio で実行します。
  2. ピアソン相関解析を適用して、遺伝子の共発現パターンを調べます。
  3. P < 0.05で統計的有意性を確保します。
    注: プロトコルを開始する前に、すべてのソフトウェアと R パッケージが正しくインストールされ、最新バージョンに更新されていることを確認してください。

結果

ここでは、NAFLDとMIの根底にある分子メカニズムを解明するために行われたさまざまな分析を網羅して、提案された研究の主要な結果を示します。

DEGの識別
GSE89632データセットでは、76のアップレギュレーション遺伝子と20のダウンレギュレーション遺伝子がNAFLD-DEGとして同定され(図2B、D)、GSE66360...

ディスカッション

この研究で説明した方法は、NAFLDとMIの根底にある分子メカニズムの研究に重要な意味を持っています。THBS1 などの主要なバイオマーカーを特定することにより、提案されたプロトコルは、診断介入と治療介入の両方の潜在的な標的を提供します。このアプローチは、複数の経路や免疫応答が関与する他の複雑な疾患にも拡張でき、新しいバイオマーカーや治療標的?...

開示事項

何一つ。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金会(U21A200949年62271511号)、南方戦区司令部玉才総合病院基金会(2022NZC011)、広州科学技術プログラムプロジェクト(2023A03J0170)、国立老年医学臨床研究センター(NCRCG-PLAGH-2023006)、広東省基礎応用基礎研究基金会(No.2020A1515010288、No.2021A1515220101)の支援を受けて行われました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
CytoscapeCytoscape ConsortiumVersion 3.6.1Used for visualizing protein-protein interaction (PPI) networks
MI dataset GSE66360 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).NCBI-GEO database -To collect RNA microarray datasets for analysis
R package clusterProfilerBioconductor -Used for GO, KEGG, and DO enrichment analyses
R package ggplot2CRAN -Used for creating Venn diagrams and other visualizations
R package GSEABaseBioconductor -Used in conjunction with GSVA for gene set enrichment analysis
R package GSVABioconductor -Used for single-sample gene set enrichment analysis (ssGSEA)
R package limmaBioconductor -Used for identifying differentially expressed genes (DEGs)
R package pheatmapCRAN -Used for generating heatmaps
R package vennCRAN -Used for creating Venn diagrams
RNA microarray datasets (GSE66360, GSE89632)NCBI-GEO -Publicly available RNA microarray datasets used for analysis
RStudioRStudio, PBCVersion 1.4.1717Integrated development environment for R
String databaseSTRING (www.string-db.org/) -Online tool for constructing PPI networks

参考文献

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