JoVE Logo
저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

본 연구는 동시 발현 유전자를 통해 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)과 심근경색(MI)의 관계를 조사하여 트롬보스폰딘 1(THBS1)을 바이오마커로 확인하였다. 면역 침투 분석은 CD8+ T 세포와 호중구가 핵심 인자로 밝혀졌으며, THBS1은 NAFLD 및 MI의 진단 도구로서 잠재력을 보여주었습니다.

초록

비알코올성 지방간 질환(NAFLD)과 심근 경색(MI)은 유병률과 사망률이 높은 두 가지 주요 건강 부담입니다. 본 연구는 생물정보학 및 머신러닝을 이용하여 NAFLD와 MI의 관계를 이해하고 NAFLD 관련 MI의 잠재적으로 중요한 바이오마커를 식별하기 위해 동시 발현된 유전자를 탐색하는 것을 목표로 했습니다. 기능적 농축 분석을 수행하고, PPI(co-protein-protein interaction) 네트워크 다이어그램을 구성하고, SVM-RFE(vector machine-recursive feature elimination) 및 LASSO(least absolute shrinkage and selection operator) 기술을 사용하여 하나의 차등 발현 유전자(DEG), Thrombospondin 1(THBS1)을 식별했습니다. THBS1은 NAFLD 환자(AUC = 0.981)와 MI 환자(AUC = 0.900)를 구별하는 데 강력한 성능을 보였다. 면역 침투 분석에서 NAFLD 및 MI 환자에서 CD8+ T 세포가 현저히 낮고 호중구 수치가 높은 것으로 나타났습니다. CD8+ T 세포와 호중구는 NAFLD/MI를 건강한 대조군과 구별하는 데 효과적이었습니다. 상관관계 분석은 THBS1이 NAFLD 및 MI 환자에서 CCR(케모카인 수용체), MHC 클래스(주요 조직적합성 복합체 클래스), 호중구, parainflammation 및 Tfh(여포 도우미 T 세포)와 양의 상관관계를 보였으며 CD8+ T 세포, 세포 용해 활성 및 TIL(종양 침투 림프구)과 음의 상관관계를 보였습니다. THBS1은 건강한 대조군과 비교하여 NAFLD/MI를 진단하기 위한 새로운 바이오마커로 부상했습니다. 연구 결과는 CD8+ T 세포와 호중구가 NAFLD/MI 환자를 건강한 사람과 구별하기 위한 염증성 면역 기능으로 작용할 수 있음을 나타냅니다.

서문

비알코올성 지방간 질환(NAFLD)은 유병률이 25%-30%1인 주요 공중 보건 문제입니다. NAFLD의 유병률은 당뇨병2 환자에서 높은 것으로 보고되었습니다. 그러나 비당뇨병 환자에서 NAFLD의 중요성은 아직 명확하지 않습니다. 연구에 따르면 NAFLD는 죽상동맥경화증의 발병기전에 독립적인 역할을 한다고 합니다 3,4. 또한, 메타 분석에 따르면 NAFLD는 관상동맥 석회화, 내피 기능 장애 및 죽상동맥경화증과 밀접한 관련이 있으며, 독립적인 심혈관 위험 인자로 부상하고 있다5. NAFLD와 심혈관 질환 사이의 연관성은 여전히 추가 연구가 필요합니다.

심근경색(MI)은 건강을 위협하고 전 세계 환자와 그 가족에게 상당한 경제적 부담을 주는 치명적인 질병입니다6. MI는 또한 NAFLD 환자의 주요 사망 원인입니다. 영국 의학 저널(British Medical Journal)에 발표된 임상 연구에 따르면 NAFLD 환자의 심근경색 위험은 NAFLD가없는 환자보다 1.17배 더 높다고 7,8. 일부 연구에서는 염증, 산화 스트레스 및 지질 대사를 포함한 분자 경로가 NAFLD 관련 MI 9,10,11에 기여하는 것으로 확인되었습니다. 그러나 NAFLD와 MI를 연결하는 기본 메커니즘은 여전히 불분명합니다. NAFLD 및 MI의 예후와 관련된 새로운 바이오마커를 식별하는 것이 중요합니다.

광범위한 인구 집단에 영향을 미치는 NAFLD의 유병률 증가는 특히 당뇨병과의 연관성을 고려할 때 중요한 공중 보건 문제를 강조합니다. 그러나 NAFLD가 당뇨병이 없는 환자에게 미치는 영향은 여전히 잘 알려져 있지 않습니다. NAFLD는 죽상동맥경화증의 발병기전과 관련이 있으며 관상동맥 석회화, 내피 기능 장애 및 죽상동맥경화증과 밀접한 관련이 있는 독립적인 심혈관 위험 인자로 인식되고 있습니다. 이러한 연관성에도 불구하고, NAFLD와 심근경색(MI)과 같은 심혈관 질환을 연결하는 정확한 메커니즘은 추가적인 규명이 필요합니다. MI는 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나이며 상당한 경제적 부담을 안겨줍니다. NAFLD 환자의 MI 위험은 NAFLD가 없는 환자보다 현저히 높으며, 이는 이러한 상태를 연결하는 분자 경로에 대한 더 깊은 이해의 필요성을 강조합니다. 염증, 산화 스트레스 및 지질 대사가 원인으로 제시되었지만 정확한 메커니즘은 불분명합니다. NAFLD 관련 MI의 예후 및 관리에 대한 통찰력을 제공할 수 있는 새로운 바이오마커를 시급히 식별해야 합니다.

결과적으로 본 연구에서는 NAFLD와 MI 간의 차등 발현 유전자(DEG)의 상호 작용을 식별하고 분석하기 위해 NCBI-GEO(National Center for Biotechnology Information-Gene Expression Omnibus, 재료 표 참조)에서 NAFLD 및 MI에 대한 RNA 마이크로어레이 데이터 세트를 다운로드했습니다.농축 분석, 단백질-단백질 상호 작용(PPI) 네트워크 다이어그램 구성, 벡터 기계 재귀 기능 제거(SVM-RFE) 지원, 허브 유전자 12,13,14,15,16,17,18,19를 식별하기 위해 최소 절대 수축 및 선택 연산자(LASSO) 알고리즘을 사용했습니다. NAFLD 및 MI 환자의 면역 세포를 검사하기 위해 면역 침윤 분석을 수행했습니다. 궁극적으로 이러한 방법은 NAFLD와 MI 사이의 관계를 밝히기 위해 통합되었습니다. 그림 1은 이 연구에서 따랐던 설계 순서를 보여줍니다. 본 연구는 생물정보학, 머신러닝, 면역침투분석을 결합하여 새로운 의학적 의사결정 지원 플랫폼 개발에 기여하고자 한다.

이 논문의 주요 기여는 다음과 같습니다: (1) 동시 발현 유전자 식별: 이 연구는 동시 발현 유전자를 식별하여 NAFLD와 MI 간의 관계를 강조하고 이 두 상태 사이의 분자 연결에 대한 더 깊은 이해를 제공합니다. (2) 생물정보학 및 기계 학습의 응용: SVM-RFE(support vector machine-recursive feature removal)17 및 LASSO(least absolute shrinkage and selection operator)19를 포함한 생물정보학 및 기계 학습 기술을 사용하여 이 연구는 THBS1을 차등적으로 발현된 유전자로 식별합니다. THBS1은 NAFLD 및 MI 환자를 건강한 대조군과 구별하는 데 높은 성능을 보여줍니다. (3) 면역 침윤 분석: 이 연구는 면역 침윤 분석을 수행하여 NAFLD 및 MI 환자에서 CD8+ T 세포 수치가 현저히 낮고 호중구 수치가 높은 것을 밝혔습니다.(4) 상관 관계 분석: 이 연구는 THBS1이 CCR(케모카인 수용체), MHC 클래스 I(주요 조직 적합성 복합체 클래스 I), 호중구, parainflammation, 및 Tfh (follicular helper T) 세포. 이는 CD8+ T 세포, 세포 용해 활성 및 종양 침윤 림프구(TIL)와 음의 상관관계가 있습니다.

프로토콜

사용된 데이터베이스, 웹링크 및 소프트웨어/패키지에 대한 자세한 내용은 Table of Materials에 나열되어 있습니다. 사용된 시뮬레이션 매개변수는 표 1에 나와 있습니다.

1. RNA 마이크로어레이 데이터 세트 얻기

  1. NCBI-GEO 데이터베이스에서 심근경색(MI) 데이터셋 GSE66360을 다운로드합니다.
  2. NCBI-GEO 데이터베이스에서 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 데이터셋 GSE89632를 다운로드합니다.
  3. 다운로드한 데이터 세트에 49개의 MI 샘플, GSE66360에 대한 50개의 정상 대조군, 39개의 NAFLD 샘플 및 GSE89632에 대한 24개의 정상 대조군이 포함되어 있는지 확인합니다.

2. DEG의 식별

  1. 데이터 전처리 및 DEG 식별
    1. 적절한 R 함수를 사용하여 데이터 세트를 RStudio 에 로드합니다.
    2. R 패키지 limma를 사용하여 P < 0.05P 및 | log FC | > 1.5 임계값을 가진 DEG12를 식별합니다.
    3. R 패키지 pheatmap, ggplot2 및 Venn 을 사용하여 DEG 시각화를 위한 히트맵 및 Venn 다이어그램을 생성합니다.
  2. 시각화 만들기
    1. pheatmap을 사용하여 DEG의 히트맵을 생성합니다.
    2. ggplot2를 사용하여 NAFLD와 MI 간의 DEG 중첩을 보여주는 벤 다이어그램을 만듭니다.

3. 농축 분석

  1. GO, KEGG 및 DO 농축 분석 수행
    1. DEG를 R 패키지 clusterProfiler13에 로드합니다.
    2. 유전자 온톨로지(GO) 농축 분석을 수행하여 DEG를 분자 기능, 생물학적 과정 및 세포 구성 요소로 분류합니다.
    3. KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 경로 분석을 수행하여 DEG를 생화학적 경로에 매핑합니다.
    4. 질병 온톨로지(DO) 농축 분석을 사용하여 DEG를 특정 임상 상태에 연결합니다.

4. PPI 네트워크 구축을 통한 PPI 분석

  1. STRING 온라인 플랫폼14를 사용하여 신뢰도 점수가 0.4인 co-DEG의 PPI(protein-protein interaction) 네트워크 다이어그램을 구축할 수 있습니다.
  2. Cytoscape15를 사용하여 PPI 신경망을 시각화합니다.

5. 머신러닝 알고리즘 적용을 통한 후보 허브 DEG 스크리닝

  1. RStudio에서 SVM-RFE(Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination) 및 LASSO(Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) 회귀 알고리즘을 사용하여 가장 관련성이 높은 DEG 16,17,18을 선택합니다.
  2. SVM-RFE는 특징의 순위를 매기고 반복적으로 제거하는 반면, LASSO 회귀19 는 정규화를 적용하여 희소 DEG 집합을 식별합니다.

6. 진단 성능 평가를 위한 ROC 곡선 구성

  1. RStudio를 사용하여 ROC(Receiver Operating Characteristic) 곡선 분석수행 20.
  2. 중요한 co-DEG에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산합니다.

7. 면역 침투를 탐색하기 위한 면역 침투 분석

  1. R 패키지 GSVA 및 GSEABase 를 사용하여 단일 샘플 유전자 세트 농축 분석(ssGSEA)을 수행하여 NAFLD 및 MI21의 면역 침투를 분석합니다.
  2. NAFLD 및 MI 샘플과 건강한 대조군 간의 면역 세포 유형의 상대적 풍부도를 비교합니다.

8. 통계 분석

  1. RStudio에서 모든 통계 분석을 수행합니다.
  2. Pearson 상관 분석을 적용하여 유전자 공동 발현 패턴을 조사합니다.
  3. P < 0.05로 통계적 유의성을 보장합니다.
    참고: 프로토콜을 시작하기 전에 모든 소프트웨어 및 R 패키지가 올바르게 설치되고 최신 버전으로 업데이트되었는지 확인합니다.

결과

제안된 연구의 주요 결과는 NAFLD 및 MI의 기저에 있는 분자 메커니즘을 밝히기 위해 수행된 다양한 분석을 포함하여 여기에 제시되어 있습니다.

DEG 식별
GSE89632 데이터 세트에서는 76개의 상향 조절 유전자와 20개의 하향 조절 유전자가 NAFLD-DEG로 확인되었으며(그림 2B,D), GSE66360 데이터 세트에서는 118개?...

토론

이 연구에서 설명한 방법은 NAFLD 및 MI의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 연구에 중요한 의미를 갖습니다. THBS1과 같은 주요 바이오마커를 확인함으로써 제안된 프로토콜은 진단 및 치료 개입 모두에 대한 잠재적 표적을 제공합니다. 이 접근법은 여러 경로 및 면역 반응을 포함하는 다른 복잡한 질병으로 확장될 수 있어 새로운 바이오마커 및 치료 표적의 발견을 촉진할...

공개

없음.

감사의 말

본 연구는 중국국립자연과학재단(No. 62271511, U21A200949), 남방극장사령부 종합병원 유차이재단(2022NZC011), 광저우과학기술프로그램프로젝트(2023A03J0170), 국립노인임상연구센터(NCRCG-PLAGH-2023006), 광둥성 기초 및 응용기초연구재단(No.2020A1515010288, No.2021A1515220101)의 지원을 받았다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
CytoscapeCytoscape ConsortiumVersion 3.6.1Used for visualizing protein-protein interaction (PPI) networks
MI dataset GSE66360 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).NCBI-GEO database -To collect RNA microarray datasets for analysis
R package clusterProfilerBioconductor -Used for GO, KEGG, and DO enrichment analyses
R package ggplot2CRAN -Used for creating Venn diagrams and other visualizations
R package GSEABaseBioconductor -Used in conjunction with GSVA for gene set enrichment analysis
R package GSVABioconductor -Used for single-sample gene set enrichment analysis (ssGSEA)
R package limmaBioconductor -Used for identifying differentially expressed genes (DEGs)
R package pheatmapCRAN -Used for generating heatmaps
R package vennCRAN -Used for creating Venn diagrams
RNA microarray datasets (GSE66360, GSE89632)NCBI-GEO -Publicly available RNA microarray datasets used for analysis
RStudioRStudio, PBCVersion 1.4.1717Integrated development environment for R
String databaseSTRING (www.string-db.org/) -Online tool for constructing PPI networks

참고문헌

  1. de Alwis, N. M. W., Day, C. P. Non-alcoholic fatty liver disease: The mist gradually clears. J Hepatol. 48 (Suppl), S104-S112 (2008).
  2. Adams, L. A., Anstee, Q. M., Tilg, H., Targher, G. Non-alcoholic fatty liver disease and its relationship with cardiovascular disease and other extrahepatic diseases. Gut. 66 (6), 1138-1153 (2017).
  3. Bhatia, L. S., Curzen, N. P., Calder, P. C., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A new and important cardiovascular risk factor. Eur Heart J. 33 (9), 1190-1200 (2012).
  4. Boddi, M., et al. Non-alcoholic fatty liver in non-diabetic patients with acute coronary syndromes. Eur J Clin Invest. 43 (4), 429-438 (2013).
  5. Oni, E. T., et al. A systematic review: Burden and severity of subclinical cardiovascular disease among those with non-alcoholic fatty liver; should we care. Atherosclerosis. 230 (2), 258-267 (2013).
  6. Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10070), 197-210 (2017).
  7. Stahl, E. P., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and the heart: JACC state-of-the-art review. J Am Coll Cardiol. 73 (8), 948-963 (2019).
  8. Alexander, M., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and risk of incident acute myocardial infarction and stroke: findings from matched cohort study of 18 million European adults. BMJ. 367, 1934578X221093907 (2019).
  9. Cobbina, E., Akhlaghi, F. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-pathogenesis, classification, and effect on drug metabolizing enzymes and transporters. Drug Metab Rev. 49 (2), 197-211 (2017).
  10. Pawlak, M., Lefebvre, P., Staels, B. Molecular mechanism of PPARα action and its impact on lipid metabolism, inflammation and fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol. 62 (3), 720-733 (2015).
  11. Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update. Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).
  12. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 43 (7), e47 (2015).
  13. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  14. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2021: Customizable protein-protein networks, and functional characterization of user-uploaded gene/measurement sets. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D605-D612 (2021).
  15. Sriroopreddy, R., Sajeed, R., Raghuraman, P., Sudandiradoss, C. Differentially expressed gene (DEG) based protein-protein interaction (PPI) network identifies a spectrum of gene interactome, transcriptome and correlated miRNA in nondisjunction Down syndrome. Int J Biol Macromol. 122, 1080-1089 (2019).
  16. Engebretsen, S., Bohlin, J. Statistical predictions with glmnet. Clin Epigenetics. 11, 123 (2019).
  17. Ma, H., Ding, F., Wang, Y. A novel multi-innovation gradient support vector machine regression method. ISA Trans. 130, 343-359 (2022).
  18. Han, Y., Huang, L., Zhou, F. A dynamic recursive feature elimination framework (dRFE) to further refine a set of OMIC biomarkers. Bioinformatics. 37 (12), 2183-2189 (2021).
  19. Colombani, C., et al. Application of Bayesian least absolute shrinkage and selection operator (LASSO) and BayesCπ methods for genomic selection in French Holstein and Montbéliarde breeds. J Dairy Sci. 96 (2), 575-591 (2013).
  20. Gamper, M., et al. Gene expression profile of bladder tissue of patients with ulcerative interstitial cystitis. BMC Genomics. 10 (1), 1-17 (2009).
  21. Hänzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. GSVA: Gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 14, 1-15 (2013).
  22. Valbusa, F., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and increased risk of all-cause mortality in elderly patients admitted for acute heart failure. Int J Cardiol. 265, 162-168 (2018).
  23. Zhang, Q., et al. Identification of hub biomarkers of myocardial infarction by single-cell sequencing, bioinformatics, and machine learning. Front Cardiovasc Med. 9, 939972 (2022).
  24. Zhang, Q., et al. 7-Hydroxyflavone alleviates myocardial ischemia/reperfusion injury in rats by regulating inflammation. Molecules. 27 (17), 5371 (2022).
  25. Zhang, Q., Guo, Y., Zhang, D. Network pharmacology integrated with molecular docking elucidates the mechanism of wuwei yuganzi san for the treatment of coronary heart disease. Nat Prod Commun. 17 (1), 1934578X221093907 (2022).
  26. Baenziger, N. L., Brodie, G., Majerus, P. W. A thrombin-sensitive protein of human platelet membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 68 (2), 240-243 (1971).
  27. Zhang, N., Aiyasiding, X., Li, W. J., Liao, H. H., Tang, Q. Z. Neutrophil degranulation and myocardial infarction. Cell Commun Signal. 20 (1), 50 (2022).
  28. Lawler, J. Thrombospondin-1 as an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. J Cell Mol Med. 6 (1), 1-12 (2002).
  29. Kaur, S., et al. Functions of thrombospondin-1 in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (9), 4570 (2021).
  30. Asch, A. S., et al. Isolation of the thrombospondin membrane receptor. J Clin Invest. 79 (4), 1054-1061 (1987).
  31. Armstrong, L. C., Bornstein, P. Thrombospondins 1 and 2 function as inhibitors of angiogenesis. Matrix Biol. 22 (1), 63-71 (2003).
  32. Roberts, D. D., Isenberg, J. S. CD47 and thrombospondin-1 regulation of mitochondria, metabolism, and diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 321 (1), C201-C213 (2021).
  33. Emre, A., et al. Impact of non-alcoholic fatty liver disease on myocardial perfusion in non-diabetic patients undergoing primary percutaneous coronary intervention for ST-segment elevation myocardial infarction. Am J Cardiol. 116 (11), 1810-1814 (2015).
  34. Mouton, A. J., et al. Fibroblast polarization over the myocardial infarction time continuum shifts roles from inflammation to angiogenesis. Basic Res Cardiol. 114 (1), 1-16 (2019).
  35. Liu, Y., et al. Atherosclerotic conditions promote the packaging of functional microRNA-92a-3p into endothelial microvesicles. Circ Res. 124 (4), 575-587 (2019).
  36. Bai, J., et al. Thrombospondin 1 improves hepatic steatosis in diet-induced insulin-resistant mice and is associated with hepatic fat content in humans. EBioMedicine. 57 (1), 102-111 (2020).
  37. Wabitsch, S., et al. Metformin treatment rescues CD8+ T-cell response to immune checkpoint inhibitor therapy in mice with NAFLD. J Hepatol. 77 (4), 748-760 (2022).
  38. Dolejsi, T., et al. Adult T-cells impair neonatal cardiac regeneration. Eur Heart J. 43 (27), 2698-2709 (2022).
  39. Qin, Z., et al. Systemic immune-inflammation index is associated with increased urinary albumin excretion: a population-based study. Front Immunol. 13, 863640 (2022).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

1SVM RFELASSOCD8 T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유