デジタル加熱装置に基づくマウスのチェス盤状火傷創傷治癒モデル

要約

デジタル加熱装置を使用してマウスの熱傷創傷治癒モデルを確立するための合理化されたプロトコルが提示されます。皮膚上に作成されたチェス盤のような実験部位は、創傷治癒アッセイのためのさらなる機能分析を容易にします。

要約

重度の火傷は、最もトラウマ性で身体を衰弱させる状態の一つであり、ほぼすべての臓器系に影響を及ぼし、かなりの罹患率と死亡率をもたらします。その複雑さと複数の臓器の関与を考慮して、火傷のさまざまな側面を再現するために、さまざまな動物モデルが作成されています。焼けた表面を作り出すために使用される方法は、実験動物モデルによって異なります。この研究では、デジタル加熱デバイスを使用して一貫した全層燃焼を作成するための、シンプルで費用対効果が高く、ユーザーフレンドリーなマウス燃焼モデルについて説明します。この装置の先端をマウスの背部に97°Cで10秒間適用して、チェス盤のような火傷を確定し、実験的な包帯の治療下で創傷治癒を調べました。組織学的分析のために、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色、Masson染色などの皮膚サンプルを採取しました。創傷治癒は、創傷領域の分析と、炎症性浸潤、再上皮化、および肉芽組織形成の顕微鏡検査を通じて評価されました。マウスの熱傷モデルは、熱傷の病態生理学を研究し、治療的介入を評価するための基本的なツールとして役立ちます。

概要

火傷は、熱への曝露、電気、化学物質、および放射線被曝によって引き起こされる、皮膚への重大な損傷の1つと考えられています^1,2。損傷の深さに応じて、表皮から皮膚の全厚、さらには筋肉や骨まで、4つの程度に分類できます。小さな火傷は瘢痕形成につながり、感染のリスクを高める可能性があります。広範囲の火傷は、局所的な損傷を引き起こすだけでなく、重度で長期的な炎症と免疫反応を通じて、体の心臓、腎臓、その他の臓器やシステムの障害を刺激し、深刻な全身への影響と高い罹患率につながります³。ほとんどの火傷生存者は、長期にわたる身体障害、精神的苦痛、および生活の質の低下を伴います^4,5。したがって、火傷の病理学的過程と火傷組織の再生のメカニズムを研究することが重要です。

免疫応答、組織再生、および系統的恒常性に関与するin vitro研究では、火傷創治癒の病理学的プロセスを包括的に調査することはできませんでした。したがって、過去20年間で、潜在的な治療的介入を探求するために、さまざまな火傷治癒動物モデルが開発され、熱傷のさまざまな特徴を再現しました^6,7。火傷の傷は通常、脱毛後にブタ、ラット、マウス、ウサギ、およびその他の動物の背部表面に生成されます。燃焼時間は3秒から30秒続き、5%から30%の全体表面積(TBSA)⁸の範囲で部分的または全層の熱損傷を形成します。現在、火傷動物研究におけるこれらの方法の標準化されたモデルは、使用される技術のばらつきが大きいため、存在しません。燃焼面を生成するために使用される方法は、ガス炎⁹、燃焼エタノール浴¹⁰、予熱された単一金属板/^バー11,12、沸騰水または温水^13,14など、実験動物モデルによって異なります。しかし、火傷の負わせる技術と生成された火傷の深さは、多くの場合、一貫性がなく、以前の研究では十分に説明されておらず、これは火傷の重症度と火傷の治療方法を決定する上で重要です。

この研究は、シミュレートされた臨床シナリオで一貫した全層熱傷を作成するための、シンプルで費用対効果が高く、ユーザーフレンドリーなマウス熱傷動物モデルを開発することを目的としています。このプロトコルでは、便利なデジタル加熱装置を使用して、皮膚に適用される温度を調整することにより、火傷の深さを制御しました。このデバイスの先端は、TBSAのさまざまな範囲で熱傷を誘発するために、さまざまなサイズに切り替えることができます。これにより、マウスの背中にチェス盤のような火傷を形成でき、同じ動物内でいくつかの実験的治療と対照治療を比較することができます。創傷閉鎖過程を観察し、記録しました。皮膚サンプルは、創傷治癒のさまざまな段階で組織学的評価(ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色およびマッソントリクローム染色)のために採取されました。このアプローチにより、実験に使用される動物の数が減り、動物倫理との適合性を高めながら、経済的コストを削減できます。この研究は、研究者に火傷の新しい治療法の開発を促進するための重要なツールを提供し、火傷治癒の病態生理学的メカニズムを明らかにします。

プロトコル

この研究のすべての動物手順は、四川大学西中国口腔病学学校の倫理委員会 (WCHSIRB-D-2024-499) によってレビューされ、承認されました。本研究では、8週齢のC57BL/6マウス24匹(雌、体重25-30g)を用いた。試薬や使用した機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1.火傷をする前に機器とマウスを準備する

1. 動物を入手し、到着後7日間ケージに収容して、環境に順応できるようにします。
2. 70%エタノール(v / v)でスプレーして拭き取り、作業領域を滅菌します。手術台を滅菌済みの外科用吸収パッドで覆います。
3. デジタル加熱装置の温度を97°Cに調整します。 加熱装置は3つの部分で構成されています(図1)。
   注意: 50〜450°Cの温度は、温度コントローラーを介して調整できます(図1A)。スタンドベースは先端を配置するために使用され(図1B)、チップを分解して(図1C)さまざまな機器サイズと交換できます。先端をヨードフォアまたはアルコールで消毒します。
4. マウスを誘導チャンバー内の100%酸素中の5%イソフルランで3分間(流量:4 L / min)麻酔し、呼吸が遅くなるまで麻酔します。つま先ピンチテストを使用して麻酔の深さを評価します。
   注:イソフルランを吸入すると、眠気を引き起こし、心血管系に害を及ぼす可能性があります。.保護具を着用し、換気の良い場所のドラフト内で取り扱うことが不可欠です。
5. マウスに深く麻酔をかけたら、温かみを保ち、麻酔からの回復時に低体温症を防ぐために、腹臥位で加熱パッドに移します。イソフルランを1に減らします。ノーズコーン による メンテナンス用の5%酸素。
6. 角膜の乾燥を防ぐために、綿棒でマウスの両目に潤滑ジェルを塗布します。

2.全層熱傷を誘発する

注:火傷誘発と分析の一般的なプロセスを 図2に示します。

1. 首から尾までの長さ約5 cm、幅4 cmの領域で、電気シェーバーでマウスの皮膚を剃ります。シェービング時に皮膚を傷つけないように優しく働きます(図3C)。
2. 綿の先端のアプリケーターを使用して、剃った皮膚領域に脱毛クリームを3分間塗布します(図3D)。
   注:検出が困難な火傷を防ぐために、マウスの他の部分に脱毛クリームを塗布しないでください。クリームを5分以上使用すると皮膚の発疹を引き起こしました。最適な効果を得るための正確な持続時間は製品によって異なり、オペレーターが決定する必要があります。
3. 湿らせたガーゼでクリームと髪の毛が検出されなくなるまでクリームを拭き取ります。クロルヘキシジンスクラブで手術部位を消毒し、続いて70%エタノール(v / v)をそれぞれ3回消毒します。.滅菌ガーゼでその部分を清掃し、乾燥させます。
4. 滅菌インクに浸した直径9mmの滅菌済み1mLピペットチップ(図3A)を使用して、目的の創傷部位を正確に特定します。マウスの背側の皮膚は、不均一な地形が特徴です。マウスの脊髄から離れた創傷領域を定義することは、再現性を確保するために不可欠です。
5. 以前にトリミングした滅菌ドレープで皮膚を覆い、手術領域を空けます(図3)。耐熱手袋を着用し、デジタル加熱装置の温度を確認してください。燃焼誘導の前後に、デバイスの先端を70%エタノール(v / v)で消毒します。
6. 加熱装置の先端を位置する創傷部位の中心(97°Cで10秒)に当てて、直径4mmの6つの丸い創傷を作成します(図3B)。隣接する火傷の間隔は0.5〜1cmです。実験計画に従って火傷の数を決定します。
   注:火傷は主に熱伝導によって引き起こされます。したがって、ロッドに圧力をかける必要がない、つまり、燃焼誘導中に重力によってロッドを皮膚に接触させ続ける必要があります。実験計画には6つの火傷がありました。これは、使用したデバイスとマウスの背の面積に応じて構築できる火傷の最大数です。これに基づいて、同じ実験グループの複数の反復を達成できます。

3.火傷後のケアと測定

1. 火傷口に氷を5分間塗布して、疼痛管理のための潜在的な痛みを軽減します(図3G)。
2. イソフルランの電源を切り、火傷を負った後はノーズコーンを取り外します。.マウスが正常に動くまで(たとえば、しゃがんだり震えたりしない)、マウスを加熱パッドに移します。
3. 各マウスをリカバリーケージに入れて、マウス同士が引っかき傷を取らないようにします。各ペレットに5〜10滴の飲料水を追加して一部の食品ペレットを柔らかくし、ケージの床に置いて給餌を容易にします。
   注:70%エタノール(vol / vol)でスプレーおよび拭いてケージを滅菌します。寝具は、マウスを暖かく保ち、尿を吸収するために定期的に交換する必要があります。
4. ブプレノルフィン(0.1 mg / kg)を尾側の場所で1日2回、合計3日間皮下投与し、注射の間隔を少なくとも8時間確保します。.
5. 熱傷誘発の24時間後に生理食塩水で湿らせた滅菌ガーゼですべての傷を洗浄します。ガーゼで皮膚を拭き取り、注射器を使用して少量の抗菌ジェル(TKHヒドロゲル)を塗布して火傷の傷を覆います^12,14。その後、3日目、7日目、10日目にこの手順を繰り返します。
6. 傷を覆うために通気性のある透明な包帯を使用してください。包帯のサイズは、傷口の周囲約1cmを覆う必要があり、脱毛せずにその領域を覆うべきではありません。
   注意: 創傷被覆材は少なくとも2日に1回交換してください。ドレッシングを交換せずに長期間使用すると、膿の形成を伴う創傷感染を引き起こし、創傷治癒が遅れる可能性があります。
7. フォローアップ期間中は、2〜3日ごとに体重を測定します。一般的に、初期体重の15%〜20%を失ったマウスは犠牲にして実験から除外する必要があります。

4.創傷コレクション

1. 0、3、7、10、および14日後に、滅菌した1mLピペットチップの先端で傷口に印をつけ、デジタルカメラで記録します。
2. 麻酔の過剰摂取と頸部脱臼によりマウスを安楽死させます(施設で承認されたプロトコルに従います)。
   注:頸部脱臼中は、背部の傷を損傷する可能性のある過度の引っ張りを避けるために注意してください。
3. はさみで、創傷部位と周囲の皮膚(下にある筋肉組織(1 cm x 1 cm)を含む)を分離します。各グループに対して少なくとも 3 つのサンプルを準備します。
4. 皮膚標本を4%パラホルムアルデヒド(PFA)に24時間固定し、4°Cで保存します。 固定液量は、組織体積^15,16の30倍でなければなりません。
   注:PFAは危険です。換気の良い場所で作業し、適切な保護具を使用してください。

5. 創傷治癒評価

1. 創傷組織をPBSで2回洗い、適切なサイズにトリミングする濾紙で広げます(図2H)。皮下組織層内に粘液内容物が存在するため、動きや組織のカールなしに濾紙の表面に付着します。
   1. 濾紙とサンプルをパラフィン脱水用の組織カセットに入れて比較的滑らかな組織サンプルを取得し、次に組織^15,16を埋め込みます。サンプルは4°Cで保存してください。
      注:これらの折り目は固定後に永続的になるため、組織をできるだけ伸ばし、折り畳みを避けてください。
2. パラフィン包埋サンプルを厚さ5μmの切片に切断し、H&EおよびMassonのトリクロームを用いてスライドを染色し、肉芽組織、血管新生形成、およびコラーゲン沈着の程度を評価し、創傷治癒の異なる段階および進行を評価するための証拠を提供する^17,18。
3. 40倍対物レンズを備えた顕微鏡を使用して、すべてのサンプルの画像をキャプチャします。
4. 互換性のあるソフトウェアを使用して、表皮、真皮、皮下組織、筋肉の状態など、汚れた皮膚切片を分析します。

結果

このプロトコルでは、デジタル加熱装置によって、97°Cで10秒の燃焼時間でチェス盤のような火傷が作成されました(図1)。デバイスの先端は、優れた熱伝導性と高速加熱能力で知られる純銅でできています。実験者が保持するグリップはポリカーボネート素材でできており、耐熱性と不燃性を備えています。予熱された単一の金属板/棒、または?...

ディスカッション

熱傷研究の場合、in vitroモデルは通常、黄色ブドウ球菌や緑膿菌などの熱傷に関連する細菌に対する局所抗菌剤または抗生物質の阻害効果、およびさまざまな生体材料(エラスチン、シルク、ハイドロゲルドレッシング^など14,20)の影響に焦点を当てています。)の焼け後炎症細胞(好中球?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tip	KIRGEN,USA	KG1333	Used to locate burn wound sites
3 M Tegaderm film	3M,USA	1624WCN 6 cm x 7 cm	For the wound cover after burn induction
4% paraformaldehyde(PFA)	Biosharp,China	BL539A	Used to fix the skin samples
Buprenorphine	Sigma-Aldrich,USA	PHR8955-50MG	For the pain management of the mice
C57BL/6 mice	Chengdu Dashuo experimental animal company,China	none	For the establishment of burn model
Depilatory cream	Veet,China	—	For the dorsum hair removal of the mice
Digital Heating Device	Shenzhen Kapper Technology Company,China	No.936D	For the burn induction of the mice
Electric shaver	AUX,China	AUX-A5	For the dorsum hair removal of the mice
Filter paper	—	—	Used to unfold of the skin samples
GraphPad software	—	GraphPad prism 9.5.0	For the analysis of burn wound area
Heat-resistant gloves	—	—	Used to hold the digital heating device tip
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Solarbio,China	G1120	For the histological analysis of the slides
ImageJ software	—	ImageJ 1.54f	For the analysis of burn wound area
Isoflurane	RWD,China	R510-22-10	For the anesthesia of the mice
Masson's Trichrome Stain Kit	Solarbio,China	G1340	For the histological analysis of the slides
Microscope	Olympus,Japan	VS200 ASW	Used to scan the H&E and Masson stained slides
Tissue cassette	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD,China	31050102W	For tissue paraffin dehydration and paraffin embedding