체스판과 같은 화상 상처 치유 모델 디지털 난방 장치를 기반으로 한 마우스의

요약

디지털 가열 장치를 사용하여 마우스의 화상 상처 치유 모델을 구축하기 위한 간소화된 프로토콜이 제시됩니다. 피부에 만들어진 체스판과 같은 실험 부위는 상처 치유 분석을 위한 추가 기능 분석을 용이하게 합니다.

초록

심각한 화상 부상은 가장 충격적이고 신체적으로 쇠약해지는 상태 중 하나이며 거의 모든 장기 시스템에 영향을 미치고 상당한 이환율과 사망률을 초래합니다. 화상의 복잡성과 여러 장기의 관여를 감안할 때, 화상 부상의 다양한 측면을 복제하기 위해 다양한 동물 모델이 만들어졌습니다. 불에 탄 표면을 만드는 데 사용되는 방법은 실험 동물 모델마다 다릅니다. 이 연구는 디지털 가열 장치를 사용하여 일관된 전체 두께 화상을 생성하기 위한 간단하고 비용 효율적이며 사용자 친화적인 마우스 화상 모델을 설명합니다. 이 장치의 끝을 97°C에서 10초 동안 마우스의 등쪽에 적용하여 체스판과 같은 화상을 입히고 실험용 드레싱 처리로 상처 치유를 조사했습니다. Hematoxylin 및 Eosin(H&E) 염색 및 Masson's 염색을 포함한 조직학적 분석을 위해 피부 샘플을 수집했습니다. 상처 부위 분석과 염증성 침투, 재상피화, 육아 조직 형성에 대한 현미경 검사를 통해 상처 치유를 평가하였다. 생쥐 화상 부상 모델은 열 부상의 병태 생리학을 연구하고 치료 개입을 평가하는 데 기본적인 도구 역할을 할 수 있습니다.

서문

화상은 열 노출, 전기, 화학 물질 및 방사선 노출로 인해 발생하는 피부에 대한 심각한 부상 중 하나로 간주됩니다 ^1,2. 부상의 깊이에 따라 표피에서 피부의 전체 두께, 심지어 근육과 뼈에 이르기까지 4단계로 분류할 수 있습니다. 작은 화상은 흉터를 형성하고 감염 위험을 증가시킬 수 있습니다. 넓은 부위의 화상은 국소 손상을 일으킬 뿐만 아니라 심각하고 장기적인 염증과 면역 반응을 통해 신체의 심장, 신장 및 기타 장기 또는 시스템의 장애를 자극하여 심각한 전신 질환과 높은 이환율을 초래합니다³. 대부분의 화상 부상 생존자는 장기적인 신체 장애, 정서적 고통 및 삶의 질 저하를 동반합니다 ^4,5. 따라서 화상의 병리학적 과정과 화상받은 조직의 재생 메커니즘을 연구하는 것이 중요합니다.

면역 반응, 조직 재생 및 체계적인 항상성과 관련된 체외 연구는 화상 상처 치유의 병리학적 과정을 종합적으로 조사할 수 없었습니다. 따라서 지난 20년 동안 잠재적인 치료 개입을 모색하기 위해 화상 부상의 다양한 특징을 복제하기 위해 다양한 화상 상처 치유 동물 모델이 개발되었습니다 ^6,7. 화상 상처는 일반적으로 제모 후 돼지, 쥐, 생쥐, 토끼 및 기타 동물의 등쪽 표면에 생성됩니다. 연소 시간은 3초에서 30초 동안 지속되어 총 신체 표면적(TBSA⁾⁸%에서 5%에서 30%의 범위로 부분적인 두께에서 전체 두께의 열 손상을 형성할 수 있습니다. 사용되는 기술의 높은 가변성으로 인해 현재 화상 동물 연구에서 이러한 방법의 표준화된 모델은 없습니다. 가스 화염 9, 연소 에탄올 수조¹⁰, 예열 된 단일 금속판 / 막대^{11, 12}, 끓는 물 또는 뜨거운 물^{13, 14}를 포함하여 연소 된 표면을 생산하는 데 사용되는 방법은 실험 동물 모델에 따라 다릅니다. 그러나 화상 가해 기술과 생성된 화상 깊이는 종종 일관성이 없고 이전 연구에서 제대로 설명되지 않았으며, 이는 화상의 심각성과 화상 치료 방법을 결정하는 데 중요합니다.

이 연구는 시뮬레이션된 임상 시나리오에서 일관된 전층 화상을 생성하기 위한 간단하고 비용 효율적이며 사용자 친화적인 마우스 화상 동물 모델을 개발하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜에서는 편리한 디지털 가열 장치를 사용하여 피부에 가해지는 온도를 조정하여 화상의 깊이를 제어했습니다. 이 장치의 끝을 다른 크기로 전환하여 다양한 범위의 TBSA로 열 화상을 유발할 수 있습니다. 이를 통해 마우스의 등에 체스판과 같은 화상 상처를 만들 수 있으며, 동일한 동물 내에서 여러 실험 및 대조 치료를 비교할 수 있습니다. 우리는 상처 봉합 과정을 관찰하고 기록했습니다. 상처 치유의 여러 단계에서 조직학적 평가(Hematoxylin 및 Eosin (H&E) 염색 및 Masson의 삼색 염색)을 위해 피부 샘플을 채취했습니다. 이 접근 방식은 실험에 사용되는 동물의 수를 줄여 동물 윤리와 더 잘 어울리는 동시에 경제적 비용을 절감합니다. 이 연구는 연구자들에게 화상 부상에 대한 새로운 치료법 개발을 촉진하고 화상 상처 치유의 병태 생리학적 메커니즘을 밝히는 데 필수적인 도구를 제공할 것입니다.

프로토콜

이 연구의 모든 동물 절차는 쓰촨대학교 서중국 구강학대학원 윤리위원회(WCHSIRB-D-2024-499)에서 검토 및 승인했습니다. 본 연구를 위해 8주 된 C57BL/6 마우스 24마리(암컷, 체중 25-30g)를 사용했습니다. 시약과 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 화상 부상 전 장비 및 마우스 준비

1. 동물을 입양하여 도착 후 7일 동안 우리에 수용하여 환경에 적응할 수 있도록 합니다.
2. 70% 에탄올(v/v)을 분무하고 닦아 작업 영역을 살균합니다. 멸균 수술용 흡수 패드로 수술대를 덮으십시오.
3. 디지털 가열 장치의 온도를 97°C로 조정합니다. 가열 장치는 세 부분으로 구성됩니다(그림 1).
   알림: 온도 컨트롤러를 통해 50-450°C의 온도를 조정할 수 있습니다(그림 1A). 스탠드 베이스는 팁(그림 1B)을 배치하는 데 사용되며, 다양한 크기의 기기를 교체하기 위해 분해할 수 있습니다(그림 1C). 팁을 요오드 또는 알코올로 소독하십시오.
4. 호흡이 느려질 때까지 유도 챔버에서 5% 산소에 100% 이소플루란을 넣은 마우스를 3분(유속: 4L/분) 동안 마취합니다. 발가락 꼬집음 테스트를 사용하여 마취 깊이를 평가합니다.
   참고: 이소플루란을 흡입하면 졸음이 유발되고 심혈관계에 해를 끼칠 수 있습니다. 보호 장비를 착용하고 환기가 잘 되는 곳의 흄 후드 내에서 취급하는 것이 필수적입니다.
5. 마우스가 완전히 마취되면 엎드린 자세로 가열된 패드로 옮겨 보온을 유지하고 마취 후 회복 중 저체온증을 예방합니다. 이소플루란을 1로 줄입니다. 노즈 콘을 통한 유지 보수를 위한 5% 산소.
6. 각막 건조를 방지하기 위해 면봉으로 마우스의 양쪽 눈에 윤활 젤을 바르십시오.

2. 전층 화상 부상 유발

참고: 연소 유도 및 분석의 일반적인 프로세스는 그림 2에 나와 있습니다.

1. 전기 면도기로 목에서 꼬리까지 길이 약 5cm, 너비 4cm의 부위에 걸쳐 마우스의 피부를 면도합니다. 면도 시 피부가 다치지 않도록 부드럽게 작업하십시오(그림 3C).
2. 면봉 애플리케이터를 사용하여 면도한 피부 부위에 제모 크림을 3분 동안 바릅니다(그림 3D).
   알림: 감지하기 어려울 수 있는 화상을 방지하기 위해 마우스의 다른 부분에 제모 크림을 바르지 마십시오. 크림은 5분 이상 사용하면 피부 발진을 일으켰습니다. 최적의 효능을 위한 정확한 지속 기간은 제품마다 다르며 작업자가 결정해야 합니다.
3. 젖은 거즈를 사용하여 크림을 닦아내면 크림과 머리카락이 감지되지 않을 때까지 합니다. 클로르헥시딘 스크럽으로 수술 부위를 소독한 후 70% 에탄올(v/v)을 각각 3회 투여합니다. 멸균 거즈로 해당 부위를 청소하고 말리십시오.
4. 멸균된 잉크에 담근 직경 9mm(그림 3A)의 멸균된 1mL 피펫 팁을 사용하여 원하는 상처 부위를 정확하게 찾아냅니다. 쥐의 등쪽 피부는 고르지 않은 지형이 특징입니다. 생쥐의 척수와 상처 부위를 구분하는 것은 반복성을 보장하기 위해 필수적입니다.
5. 이전에 다듬은 멸균 드레이프로 피부를 덮고 수술 부위는 자유롭게 둡니다(그림 3). 내열 장갑을 끼고 디지털 난방 장치의 온도를 확인하십시오. 연소 유도 전후에 장치의 팁을 70% 에탄올(v/v)로 소독하십시오.
6. 가열 장치의 끝을 위치한 상처 부위의 중심(97°C에서 10초)에 적용하여 직경 4mm의 둥근 상처 6개를 만듭니다(그림 3B). 인접한 화상 사이의 간격은 0.5-1cm입니다. 실험 설계에 따라 화상 횟수를 결정합니다.
   알림: 화상은 주로 열전도에 의해 발생합니다. 따라서 막대에 압력을 가하는 것, 즉 연소 유도하는 동안 중력에 의해 피부에 접촉을 유지할 필요가 없습니다. 실험 설계를 위해 6번의 연소가 있었습니다. 이것은 우리가 사용한 장치와 마우스 등쪽의 면적에 따라 만들 수 있는 최대 화상 상처 수입니다. 이를 기반으로 동일한 실험 그룹의 여러 반복을 달성할 수 있습니다.

3. 화상 후 관리 및 측정

1. 통증 관리를 위해 잠재적인 통증을 줄이기 위해 화상 상처에 5분 동안 얼음을 대십시오(그림 3G).
2. 이소플루란을 끄고 화상 부상 후 콧방울을 제거합니다. 마우스가 정상적으로 움직일 때까지(예: 웅크리거나 떨지 않음) 마우스를 가열 패드로 옮깁니다.
3. 각 마우스를 복구 케이지에 넣어 서로 긁히지 않도록 합니다. 각 펠릿에 식수 5-10방울을 추가하여 일부 식품 펠릿을 부드럽게 하고 케이지 바닥에 놓아 더 쉽게 먹일 수 있습니다.
   참고: 70% 에탄올(vol/vol)을 분무하고 닦아 케이지를 살균합니다. 침구는 쥐를 따뜻하게 유지하고 소변을 흡수하기 위해 정기적으로 교체해야 합니다.
4. 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 총 3일 동안 하루 2회 꼬리 위치에 피하 투여하고 주사 사이에 최소 8시간을 확보합니다.
5. 화상 유도 후 24시간 후에 식염수를 적신 멸균 거즈로 모든 상처를 청소하십시오. 거즈로 피부를 닦아내고 주사기를 사용하여 소량의 항균 젤(TKH 하이드로겔)을 바르면 화상 상처를 덮을 수 있습니다^12,14. 그 후 3일, 7일, 10일에 이 절차를 반복합니다.
6. 통기성이 있고 투명한 드레싱을 사용하여 상처를 덮습니다. 드레싱의 크기는 상처 주위를 약 1cm 정도 덮어야 하며 제모하지 않고 해당 부위를 덮지 않아야 합니다.
   참고: 적어도 2일에 한 번 상처 드레싱을 교체하십시오. 드레싱을 교체하지 않고 장기간 사용하면 고름이 형성되는 상처 감염으로 이어져 상처 치유가 지연될 수 있습니다.
7. 추적 기간 동안 2-3일마다 체중을 측정하십시오. 일반적으로 초기 체중의 15%-20%를 감량한 마우스는 희생하고 실험에서 제거해야 합니다.

4. 상처 채취

1. 0, 3, 7, 10, 14일이 되면 멸균 1mL 피펫 팁 끝으로 상처를 표시하고 디지털 카메라로 기록합니다.
2. 마취 및 자궁 경부 탈구를 과다 투여하여 생쥐를 안락사시킵니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름).
   알림: 경추 탈구 중에는 등쪽 상처를 손상시킬 수 있는 과도한 당김을 피하기 위해 주의하십시오.
3. 가위로 상처 부위와 밑에 있는 근육 조직(1cm x 1cm)을 포함한 주변 피부를 분리하십시오. 각 그룹에 대해 최소 3개의 샘플을 준비합니다.
4. 피부 표본을 4% 파라포름알데히드(PFA)에 24시간 동안 고정하고 4°C에서 보관합니다. 정착 부피는 조직 부피^15,16의 30배여야 합니다.
   참고: PFA는 위험합니다. 환기가 잘 되는 곳에서 작업하고 적절한 보호 장비를 사용하십시오.

5. 상처 치유 평가

1. PBS로 상처 조직을 두 번 씻고 여과지로 펴서 적절한 크기로 다듬어야 합니다(그림 2H). 피하 조직층 내에 약간의 점액 함량이 존재하기 때문에 움직임이나 조직 말림 없이 여과지 표면에 부착됩니다.
   1. 파라핀 탈수를 위한 조직 카세트에 여과지와 샘플을 넣어 비교적 매끄러운 조직 샘플을 얻은 다음 조직^15,16을 삽입합니다. 시료는 4°C에서 보관하십시오.
      알림: 이러한 주름은 고정 후 영구적이 되므로 가능한 한 조직을 늘리고 접히지 않도록 하십시오.
2. 파라핀이 함유된 샘플을 5μm 두께의 절편으로 절단하고 H&E 및 Masson의 트리크롬을 통해 슬라이드를 염색하여 과립 조직, 혈관 신생 형성 및 콜라겐 침착의 정도를 평가하여 상처 치유의 여러 단계와 진행을 평가하기 위한 증거를 제공합니다^17,18.
3. 40x 대물렌즈가 있는 현미경을 사용하여 모든 샘플의 이미지를 캡처합니다.
4. 호환 가능한 소프트웨어를 사용하여 표피, 진피, 피하 조직 및 근육 상태를 포함한 얼룩진 피부 부분을 분석합니다.

결과

이 프로토콜에서는 디지털 가열 장치에 의해 97°C에서 10초의 화상 지속 시간으로 체스판과 같은 화상 상처가 생성되었습니다(그림 1). 장치의 팁은 우수한 열전도와 빠른 가열 능력으로 알려진 순동으로 만들어졌습니다. 실험자가 잡은 그립은 내열성과 불연성을 제공하는 폴리카보네이트 소재로 만들어졌습니다. 예열된 단일 금속판/바 또는 끓는 ?...

토론

화상 연구의 경우, 체외 모델은 일반적으로 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)과 같은 화상과 관련된 박테리아에 대한 국소 항균제 또는 항생제의 억제 효과와 다양한 생체 재료(예: 엘라스틴, 실크, 하이드로겔 드레싱^14,20)의 영향에 초점을 맞춥니다) 화상 후 염...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tip	KIRGEN,USA	KG1333	Used to locate burn wound sites
3 M Tegaderm film	3M,USA	1624WCN 6 cm x 7 cm	For the wound cover after burn induction
4% paraformaldehyde(PFA)	Biosharp,China	BL539A	Used to fix the skin samples
Buprenorphine	Sigma-Aldrich,USA	PHR8955-50MG	For the pain management of the mice
C57BL/6 mice	Chengdu Dashuo experimental animal company,China	none	For the establishment of burn model
Depilatory cream	Veet,China	—	For the dorsum hair removal of the mice
Digital Heating Device	Shenzhen Kapper Technology Company,China	No.936D	For the burn induction of the mice
Electric shaver	AUX,China	AUX-A5	For the dorsum hair removal of the mice
Filter paper	—	—	Used to unfold of the skin samples
GraphPad software	—	GraphPad prism 9.5.0	For the analysis of burn wound area
Heat-resistant gloves	—	—	Used to hold the digital heating device tip
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Solarbio,China	G1120	For the histological analysis of the slides
ImageJ software	—	ImageJ 1.54f	For the analysis of burn wound area
Isoflurane	RWD,China	R510-22-10	For the anesthesia of the mice
Masson's Trichrome Stain Kit	Solarbio,China	G1340	For the histological analysis of the slides
Microscope	Olympus,Japan	VS200 ASW	Used to scan the H&E and Masson stained slides
Tissue cassette	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD,China	31050102W	For tissue paraffin dehydration and paraffin embedding