1. セットアップ

1. 微生物を含む任意の作業を開始する前に、70%エタノールを使用してワークスペースを殺菌します。常に必要なPPE(ラボコートと手袋)を使用してください。
2. 1xアンピシリンを含むLB寒天プレート、市販のP1ファージ溶解液、クロロホルム、1Mクエン酸ナトリウム、グリセロール、および殺菌前のプラスチックピペットチップとセル拡散機の箱が近くにあることを確認してください。
3. オートクレーブによって滅菌LBを準備し、LB塩溶液の3つの1 mLアリコートを作るためにそれを使用します。
   1. mM MgCl₂ (952.11-2.3803 μg), 5 mM CaCl₂ (11.098 mg), 0.1-0.2% ブドウ糖 (100-200 μg)
   2. mM MgSO₄ (12.0366 mg), 5 mM CaCl₂ (11.098 mg)
   3. mM ク硝酸ナトリウム (25.806 mg)
4. 完成したら、70%のエタノールで手袋と同様に、すべての表面を殺菌し、手を洗います。

2. プロトコル

1. ドナーファージリサート製剤
   1. LBでドナーW3110株大腸菌の1mL培養を37°Cで一晩増殖させ、220rpmで振盪を起こす。
   2. この一晩培養 1:100 を 1 mL の新鮮な LB 1 mL で希釈し、10-25 mM MgCl_2、5mM CaCl_2、および 0.1-0.2% グルコースを補充した。
   3. この細菌希釈を37°Cで2時間、通気と220rpmで振ります。
   4. これらの細胞が早期対数成長期(顕著な成長とわずかな濁り)に達したら、市販のP1ファージの40 μLを追加し、通気と220rpmで振って37°Cで残します。
      1. ファージ添加の前に、これらの細胞の600nmで測定された光学密度は、約0.4(6)でなければなりません。
   5. 培養がリズするまで1~3時間細胞を監視します。
      1. Lysisは、細胞の破片の増加だけでなく、濁度の顕著な減少をもたらす(すなわち、細胞は、培養を通して見ることができたら、細胞がlyslysと見なされます)。
   6. 塩分にクロロホルムの数滴(50-100 μL)を加え、渦で混合します。
      1. クロロホルムは、残りのドナー細胞を殺すことによってファージリサートを殺菌し、ファージだけを残し、このリサートのツチエーターを増加させる。
   7. 遠心分離機は2分間14,000rpmでライサートし、破片を除去し、上清を新鮮なチューブに移します。
   8. クロロホルムを数滴加え、1日以上4°Cに保存します。
2. 伝達
   1. レシピエントJ53株大腸菌の1mL培養を37°CでLBで一晩成長させ、220rpmで通気および振盪を行う。
   2. ドナーファージライザート(2.1)の100 μLを1.5mLマイクロフュージチューブに移し、キャップを37°Cで30分間開けてインキュベートします。
      1. このインキュベーションは、P1溶解液中の残りのクロロホルムをレシピエント細胞に添加する前に蒸発することを可能にする。
   3. 6,000rpmで5分間遠心分離によるペレットレシピエント株細胞。
   4. 100 mM MgSO₄および 5 mM CaCl₂を含む新鮮な LB の 300 μL でこれらの細胞を再中断します。(P1ファージは、感染するカルシウムを必要とします)。
   5. レシピエント細菌細胞を用いて2つの反応を設定し、ドナーファージライセートを調製:1)100μLレシピエントJ53株大腸菌と100μLドナーファージリサートを組み合わせた経度反応、および2)100μLレシピエントJ53株を組み合わせた陰性対照大腸菌および100 mM MgSO₄および5 mM CaCl₂を含有するLBの100 μL。
   6. 37°Cで30分間インキュベートし、220rpmで振ります。
   7. 1 mL LB および 200 μL 1M クエン酸ナトリウム (pH=5.5) を追加し、220 rpm で振盪を起こす 37 °C で 1 時間インキュベートします。
      1. クレートは、カルシウムでキレートすることによりP1の感染率を減少させるために使用され、レシピエント細菌のリシスを防止する。
      2. この溶液のインキュベーションは、アンピシリン耐性マーカーの発現を可能にする。
   8. ペレット細胞を6,000rpmで5分間遠心分離する。
   9. 100 mMクエン酸ナトリウム(pH 5.5)でLBの100 μLで細胞ペレットを再ステースします。2つのLB寒天プレート上の両方の反応のための渦およびプレート全体の溶液。
      1. LBプレートは、変換されたサンプルに対して1xアンペアを持ち、負のコントロールにはアンプを持たない必要があります。
      2. このプレート上のP1ファージ汚染は、冷凍庫の在庫を準備する前に再ストリークを必要とします。
      3. ファージを除去しない場合、これらのコロニーから成長した培養物は、カルシウムキレートの存在下でなければ成長しません。
   10. 両方のプレートから約3-4コロニーを選び、クエン酸ナトリウム100μL(pH=5.5)で広がる2つのLB寒天プレートに再びストリークします。
       1. LBプレートは、変換されたサンプルに対して1xアンペアを持ち、負のコントロールにはアンプを持たない必要があります。
   11. 一晩37°Cでプレートをインキュベートし、ファージを含まないコロニーが成長できるようにします。
   12. 両方のプレートからコロニーを選び、37°CでLBの5 mLで一晩培養し、通気と220rpmで振ります。
   13. 総培養量の4.5mLを用いてDNAミニプレップによりこれらの培養物からDNAを分離する。
       1. ヌクレアーゼフリー水の35μLを用いて溶出DNA。
       2. ナノドロップで得られた濃度を測定します。純DNAは約1.8の吸光度比(A_260/280)を生成します。
   14. 各培養の残りの0.5 mLを使用して、100%グリセロールと細菌培養の1:1混合物を作ることによって1 mLグリセロールストックを調製します。
   15. 細菌のグリセロールストックを-80 °Cで保存します。

3. データ分析と結果

1. qPCRによるトランスダクションの確認
   1. 6つのqPCR反応に対して2つのqPCRマスターミックスを準備し、3つはアンピシリン耐性遺伝子にqPCRプライマーを使用し、他の3つはハウスキーピング遺伝子にqPCRプライマーを使用します(反応あたり14.5 μL):12.5 μL qPCRバッファミックス+1μLフォワードプライマー+1μLリバースプライマー。
      1. この実験では、SYBRグリーンマスターミックスを用いて使用した。
      2. ハウスキーピング遺伝子プライマーは、DNAジャイラゼB(7)をコードする細菌遺伝子内のDNAのセグメントを増幅するように設計された。
   2. 各qPCR反応について、各反応(10.5 μL)のDNAの100 μgと14.5 μLのqPCRマスターミックスを組み合わせます。
   3. 表1に記載されているqPCRマシンとサーモサイクリングプロトコルを用いて、6つの反応すべてに対するアンピシリン耐性およびハウスキーピング遺伝子の増幅を測定した。
   4. qPCRによって生成されたCq値は、アンピシリン耐性遺伝子の正規化されたトランスダクション効率を計算するために使用され(図3)、アンピシリン耐性遺伝子の転写に成功したことを確認した。
      1. サンプルのCq値(サイクル定量値)は、信号がバックグラウンドしきい値を超えた最も早いPCRサイクル番号です。低い Cq 値は、より多くのターゲット シーケンスに対応しますが、その逆も同様です。
      2. サンプル内の遺伝子の正規化されたトランスダクション効率は、これらのCq値を使用して、標的遺伝子の値からハウスキーピング遺伝子の値を引くことによって計算することができ、正規化されたトランスダクションの計算に使用できるΔCq値を生成する。効率 2^(-ΔCq)

表 1: qPCR サーモサイクリング プロトコル