私たちは、撮影とビデオ制作におけるそれらの重要な役割のためにディックフォーリーやリーキンボールに感謝。

1。末梢血単核細胞（PBMC）分離<ol><li>血液サンプルを入手する - 血液は凝固を防ぐために注射器や血液の管と（1:50比）ヘパリンによる抗凝固に収集する必要があります。約1 ×血液1mL当たり10 6 PBMCの利回りを期待する- CD4陽性（CD4 +）T細胞となる約40％、そのうち。 </li><li> 50 mLコニカルチューブ、チューブあたり25 mLに分注し血を。血液が分離されている場合は、軽くプラズマを配布するために小分けする前に混ぜる</li><li>血管に挿入し、フィコール11 mLを策定し、慎重にピペットからピペットエイドを削除して40 mLのとアンダーレイの総容積をもたらし、PBSを追加。フィコールは徐々にチューブの底部に排出されます。レベルが均等化された後、徐々に血液チューブからピペットを取り外して廃棄します。 </li><li>血液チューブにフタをし、Aerosolveキャニスターに移動​​します。ブレーキなし - しっかりと900缶と遠心× gで20分間を閉じます。それは、制動力が細胞の層を乱すので、ブレーキがこのスピンの最後に適用されていないことが重要です。 </li><li>スピンした後、末梢血単核球は黄色のプラズマ（上記）と透明フィコール（下）の間に明確な白い層を形成すべきである。静かに転送ピペットと新しいチューブへの転送を使用して白血球の層をオフに脱脂。いくつかの血漿とフィコールは、末梢血で策定が、赤血球層のいずれかを策定回避することができます。通常2つの血液の管はペレットのサイズを増やすには、この段階で一つのセルのチューブにまとめることができます。 </li><li> 15分間500 × gで50 mLのと遠心分離する総量をもたらす、PBSを追加 - aerosolveキャニスターの低いブレーキを。 </li><li>ペレットを乱さないように注意しながら、パスツールピペットを用いて液体を吸引除去する</li><li>各チューブに5〜6 mLを加えると軽く塊を除去するために混合することにより、溶血バッファーで扱う。せいぜい5分間インキュベートします。 </li><li> 10分間、230 × gで50 mLのと遠心分離する総量をもたらす、PBSを追加 - 低いブレーキを。 Aerosolveキャニスターは、これらの低速回転のために不要になります。 </li><li> 2回洗浄：パスツールピペットを用いて吸引液を、10分間230 × gでPBSと遠心機でチューブを埋める。 </li><li>最後の洗浄工程の前に、、再懸濁した細胞のアリコートを削除するトリパンブルーで希釈し、血球計算盤を用いて数える。この細胞数は、T細胞の分離工程で使用される試薬の量が決まります。 </li></ol> 2。 CD4 + T細胞の分離* <ol><li>液体を吸引し、10万個の細胞あたり40 ULに全量を持って実行しているバッファを追加します。通常、これは、バッファに加えて残留ペレットの体積の30 ULを必要とします。 </li><li> 15 mLコニカルチューブにこのボリュームを転送します。 </li><li> CD4分離キットから抗体のカクテルを追加 - 10 10万個の細胞あたりのUL、キャップのチューブ、および10分間氷上に置きます</li><li> 、氷からチューブを外しキャップを外し、10万個の細胞あたりのバッファを実行している30 ULを追加する</li><li> CD4のアイソレーションキットから磁気ビーズを追加 - 20 10万個の細胞あたりのUL、キャップのチューブ、および15分間氷上で場所を</li><li> 10分間、230 × gで洗浄し、遠心してバッファを実行しているの10巻を追加。 </li><li>スピン中は、ワークスペース内の磁石と5mLのポリプロピレンチューブを設置</li><li> 、細胞ペレットから液を吸引除去する2mLの実行中のバッファを追加し、転送ピペットを使用して塊を取り除く</li><li>同じ転送ピペットを使用して、15分間磁石で5 mLのチューブとインキュベートに細胞を移す</li><li>慎重にCD4 +反転磁石によってマーク15mLのチューブに細胞画分をデカントし、すべてが最後の一滴を空に</li><li> 5 mLのチューブにバッファを実行しているの別の2 mlを加え磁石から削除</li><li>優しくチューブの側面と著しい15 mLの試験管に転送をオフにCD4細胞をリンス</li><li>各チューブに2 mLのT細胞の培地を追加し、10分間230 × gで細胞計数および遠心のためのアリコートを削除します。 </li><li>トリパンブルーで細胞のアリコートを希釈し、血球計算盤を用いて数える。これらの細胞数は、拡大培養のステップのために使用される井戸の数が決まります。 </li></ol> 2.11 - *また、MACSカラムとビーズ（Miltenyi Biotec社）、AutoMACS電池セパレータ（Miltenyi Biotec社）、またはRobosep電池セパレータ（幹細胞技術は）ステップ2.2の代わりに指示を製造するにしたがって使用することができます。 3。 in vitroでの拡大培養に<ol><li>細胞数に基づいて、CD4 +およびCD4細胞ペレットから液を吸引し、（通常は300万CD4 + mL当たりの細胞とmLの1千万人ものCD4細胞が培養をセットアップするためにうまく機能する）培地を加える。拡大培養は48穴培養プレートに1mLの培養培地の総体積に1ウェルあたり3〜5000000 CD4細胞と2〜3000000 CD4 +ウェルあたりの細胞が必要です。一般的に、CD4 +細胞は、限定的な集団である</li><li>必要に応じて、CD4細胞を（5000ラッド照射<html>秒）。それぞれに300〜500μLを添加することにより、48ウェルプレート上のウェルに適切な数に分注しCD4細胞。 1時間37℃のインキュベーターでプレートを置きます。 CD4細胞接着は、拡大培養で抗原提示細胞として機能します。 </li><li>インキュベーターからプレートを取り外します。 </li><li>新鮮な培地の500μLのを追加し、軽く12〜20回上下にピペッティングし、転送ピペットを用いて、液体のすべてを削除して井戸を洗浄してください。この洗浄は、付着性抗原提示細胞の層を残すだろう。 </li><li>洗浄が完了すると、各ウェルの底部（約100 UL）を濡らすのに十分なメディアを追加する - 特に接着細胞が完全に乾くだろう</li><li>各ウェルに2〜3000000 CD4 +細胞を追加。必要に応じて、1 mLのようにそれぞれの総ボリュームを起動するために追加のメディアを追加します。 </li><li>各ウェルに所望のペプチドを追加。刺激のための典型的な濃度は10 ug / mlと最後のです。 </li><li> 7日間、37℃インキュベーターで場所のプレート。 </li><li> 7日後、各ウェルにHemogen IL - 2の50のUL（または組換えIL - 2、10 IU / mLのような、相当する）を追加。 </li><li>後続の各日に、顕微鏡を用いて細胞増殖を監視する。新鮮な培地とIL - 2の50 ULを追加し、まだメディアの半分を削除することにより、コンフルエントでない井戸を養う。新鮮な培地とIL - 2の50 ULを追加して、空のウェルに細胞の半分を移動、細胞を再懸濁することによりコンフルエントに井戸を分割する。インキュベーターにセルを返します。 </li><li>拡大する細胞は、培養の13から15日後に四量体のための準備が整います。 </li></ol> 4。テトラマー染色によりT細胞の可視化<ol><li>購入するまたは刺激されたCD4 + T細胞（テトラマー試薬の源のための議論を参照）と一致するペプチド/ MHCの組み合わせと一致するように四量体を組み立てる。四量体は、〜0.5 mg / mLのソリューションでなければなりません。 </li><li>インキュベーターからプレートを取り外します</li><li>慎重に各ウェルから培地の半分をオフに描く</li><li> 5mLのポリスチレンのFACSチューブに - 通常75μLまたは約50,000細胞 - 各ウェルからの細胞のアリコートを転送する</li><li> 37と場所℃のインキュベーターに1-2時間 - 50μL合計体積当たり、通常、1μL - 四量体を追加。また、ネガティブコントロールとしてのミスマッチ四量体を各ウェルからの細胞の第2のアリコートを染色することをお勧めします。 </li><li>各抗体の30から10μLを加えることによって抗CD3、抗CD4、および抗CD25抗体でラベル細胞。追加のまたは別の抗体マーカーを使用することができます。このチャネルが四量体のために予約されている必要がありますしかし、PE標識抗体を使用しないでください。この時点で、また余分な細胞を使用して、単一の色またはアイソタイプコントロールにラベルを付けます。 </li><li>氷上または4℃で15〜30分間抗体標識された細胞をインキュベート℃に</li><li> 10分間、230 × gで0.5〜2 mLを実行しているバッファと遠心機で各チューブを洗浄する。 </li><li> FACSチューブから注意深くデカント液体。その後のFACS解析のための覆われた容器（できれば氷の上）に全てのチューブを保管してください。 </li></ol> 5。フローサイトメーターの収集と解析<ol><li>参照のビーズを使用してフローサイトメーターを較正します。 </li><li>楽器の設定を確認します。 <ol><li>未染色の対照細胞またはアイソタイプコントロールを使用して、実行可能なリンパ球ゲート（FSC対SSC）の位置を調整します。各軸上で最初の十年以下の人口を（ゲインの設定を変更することで）中心で全てのチャネルからの自家蛍光を削除します。 </li><li>単一のカラーコントロールチューブ、それぞれ単一の色の正しい象限内の中央イベント（補正の設定を変更することによって）使う。 </li><li>無関係な四量体で染色したチューブを使用して計測器の設定の微調整を行う。四量体は、多くの場合、抗体のコントロールよりも明るく染色ので、PEのチャネルのための特定の設定で調整が必要な場合があります。無関係な四量体は、CD4 +細胞の&lt;0.5％を染色してください。 </li></ol></li><li>各チューブのデータを取得する<ol><li>各サンプル管と陰性コントロールの管のためのイベントを収集</li><li>的考察のための少なくとも20,000のイベントを取得し保存</li></ol></li><li>データを分析する<ol><li>インポートデータファイルのFACS解析ソフトウェア（例えばCellQuestソフトウェア、WinMDI、またはFlowJo）へ。無関係な四量体を使用してチューブのステンドグラスを使用して、分析を開始します。 </li><li>プロットFSC対SSCとライブリンパ球（図1、左上のパネル）の周りゲートを描きます。 </li><li>プロットのCD4対CD3（ライブリンパ球のみを表示するためにゲート）とCD3 +とCD4 +集団（図1右上のパネル）の周りにゲートを描きます。 </li><li>プロットのCD4対テトラマー（のみCD3 +リンパ球を表示するためにゲート）とは、象限の境界を設定するようにCD4 +テトラマー+人口が0.5％未満（図1の左下のパネル）である。 </li><li>プロットCD25対テトラマーおよびCD25 +テトラマー+人口が0.5％未満（図1右下のパネル）になるように象限の境界を設定する（CD4 +リンパ球のみを表示するためにゲート）。 </li><li>ゲートを変更することなく、サンプルチューブのすべてを分析する。 </li></ol></li></ol>1167/JOVE％の20FIGUREの％201.png&quot;ALT =&quot;図1&quot;幅=&quot;600&quot;高さ=&quot;342&quot;/&gt; 図1代表的な負の制御テトラマー染色の結果。左上のパネルは、前方散乱の詩の側方散乱およびリンパ球サイズのゲート（R1）を示します。右上のパネルには、R1のゲートであり、ANT - CD4対抗CD3およびCD3 +（R2）とCD4 +（R3）のゲートを示しています。左下のパネルには、R2のゲートであり、四量体に対する抗CD4を示しています。右下のパネルには、R3のゲートであり、抗CD25対四量体を示しています。両方の四量体のプロットのための象限は、0.5％に設定されていました。 6。代表的な結果<ol><li>テトラマー陽性細胞は、拡張されたCD4 +細胞（図2）の間で別個の人口である必要があります。 </li><li>テトラマー陽性細胞は、通常、CD25 +と頻繁にCD4高い。 </li><li>いくつかのケースでは、MHC /ペプチドの組み合わせは、バックグラウンド染色を（多くの場合、溶解性が悪いとペプチドによって引き起こされる）与えることができます。 &quot;偽陽性&quot;細胞はテトラマー対CD4またはCD25対テトラマープロット（図3）のいずれかの単一の明確な集団ではないので、そのようなバックグラウンド染色は真陽性から区別することができます。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%202.png" alt="" width="600" height="362" /> 図2。代表正テトラマー染色の結果。パネルのレイアウトとゲーティング戦略は、図1と同一です。テトラマー陽性細胞は抗CD25対四量体のパネル上で四量体のパネルと異なるCD25 +集団に対する抗CD4で異なるCD4高い人口として表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%203.png" alt="図3" width="600" height="336" /> 図3。代表&quot;偽陽性&quot;テトラマー染色の結果。パネルのレイアウトとゲーティング戦略は、図1と同一です。四量体のパネルに対する抗CD4は、不明瞭な&quot;古墳&quot;染色を示す。抗CD25対四量体はまた、CD25 +であることに向かって明確な傾向がある&quot;古墳&quot;染色を示しています。

<ol>
	<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4++T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen.">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).</li><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetramer-guided+epitope+mapping:+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4++T+cell+epitopes+from+complex+antigens.">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).</li></ol>

免疫にCD4の役割+ T細胞を理解することは基本的に重要である。しかしながら、抗原特異的CD4 + T細胞が検出し、従来の方法を使用して分離することが困難な場合があります。対照的に、MHCクラスIIテトラマーは、所望の抗原特異性とCD4 + T細胞の直接可視化を可能にする。このビデオでは、分離、精製、およびCD4 + T細胞および四量体を使用して、その後の可視化のin vitro増幅を示しています。ク...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Class 2 Laminar flow biosafety cabinet</td>
<td>equipment</td>
<td>Thermo Forma</td>
<td>1200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>50 mL conical Tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>47747-182</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>1X PBS (Ca/Mg free)</td>
<td>Reagent</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30028.02</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Ficoll-paque PLUS</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1440-03</td>
<td>foil wrapped to protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipet Aid XP</td>
<td>equipment</td>
<td>Drummond</td>
<td>4-000-101</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>10 mL pipet</td>
<td>equipment</td>
<td>Corning/Costar</td>
<td>CLS4492</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Aerosolve Canisters</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>359481</td>
<td>with 50 mL inserts</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>GS-6R</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipets </td>
<td>equipment</td>
<td>Samco</td>
<td>202-20S</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipets</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>14672-200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemolytic Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T6146</td>
<td>0.2% in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemocytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR </td>
<td>15170-208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL conical tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>05-527-90</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Running Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-155</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>EasySep&reg; Magnet</td>
<td>equipment</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>18000</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL polypropylene tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352063</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Reagent</td>
<td> Invitrogen</td>
<td>22400-089</td>
<td>with 25 mM HEPES</td>
</tr>
<tr>
<td>Pooled human serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>1570-063</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>500mL 0.22 micron bottle top filter</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalgene</td>
<td>595-3320</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>48-well plate</td>
<td>equipment</td>
<td>Costar</td>
<td>3548</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>37&deg;C CO2 incubator</td>
<td>equipment</td>
<td>Sanyo Scientific</td>
<td>MCO-18AIC</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL synthetic peptide</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Custom synthesis from any peptide vendor</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL FACS tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352008</td>
<td>Polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Peptide loaded class II tetramer (as described)</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Prepared by the BRI tetramer core</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD3</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD pharmingen</td>
<td>347344</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD4</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>17-0049-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD25</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>11-0259-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Facs Calibur Flow Cytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>342975</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualizing antigen specific cd4+ t cells using mhc class ii tetramers

主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIIテトラマーは、抗原特異的CD4 +フローサイトメトリーによるT細胞の直接可視化を可能にする。このメソッドは、ペプチドロードされたMHCと対応するT細胞受容体との間の非常に特異的な相互作用に依存しています。単一MHC /ペプチド分子の親和性は低いですが、ストレプトアビジンとMHC /ペプチド複合体を架橋する染色試薬としての利用を可能にする、相互作用の結合力を増加させる。ためにCD4 + T細胞（単特異性30万で〜1）の比較的低い周波数からこのアッセイでは検出のしきい値を高めるためにin vitroでの増幅工程に使用しています。単核細胞をFicollの下敷きにより末梢血から精製されています。 CD4 +細胞は、その後、ビオチン化抗体カクテルとAnti - Biotin標識した磁気ビーズを用いてネガティブセレクションによって分離される。抗原提示細胞、CD4 + T細胞は抗原ペプチドとIL - 2を追加することで、メディアで展開されるようにCD4細胞分画から接着細胞を使用する。拡張された細胞は、抗CD4、抗CD3および抗CD25などの表面の抗体を用いて一時間、その後、ステンドグラス、37℃でインキュベートすることにより、対応するクラスIIテトラマーで染色されています。標識後、細胞を直接フローサイトメトリーによって分析することができます。テトラマー陽性細胞は、通常、拡張されたCD4 +細胞の間で明確な集団を形成する。テトラマー陽性細胞は、通常、CD25 +と頻繁にCD4高い。バックグラウンドのテトラマー染色のレベルが異なる場合があるため、陽性染色の結果は常に無関係の四量体と同じ細胞の染色と比較する必要があります。この基本的なアッセイの複数のバリエーションが可能です。テトラマー陽性細胞は、さらに表現型解析、ELISPOTまたは増殖アッセイに含める、または他の二次アッセイのためにソートすることができる。いくつかのグループはまた、四量体と抗サイトカインや抗Foxp3の抗体のいずれかを使用して共同で染色を実証している。

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Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

この手順では、精製および抗原特異的CD4 + MHCクラスIIテトラマーを用いて全末梢血とその可視化から、T細胞のin vitroでの展開の例を示します。四量体は、単一の抗原特異性と定義されているMHCクラスII制限とT細胞の直接可視化を可能にする。

抗原特異的CD4 + T細胞はMHCクラスIIテトラマーを用いての可視化

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

visualizing-antigen-specific-cd4-t-cells-using-mhc-class-ii-tetramers

Research

JoVE Journal

Biology

21.6K ビュー.  Benaroya Research Institute. この手順では、精製および抗原特異的CD4 + MHCクラスIIテトラマーを用いて全末梢血とその可視化から、T細胞のin vitroでの展開の例を示します。四量体は、単一の抗原特異性と定義されているMHCクラスII制限とT細胞の直接可視化を可能にする。

ビデオ: Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + Tリンパ球キャプチャHIVのための使い捨てマイクロ流体チップを用いた

生物学

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

CD4 +ミルテニーMACS精製を使用してマウスのリンパ節からT細胞の分離

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

同時にウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

弁内皮細胞の単離

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

の細胞特異的な分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;蛍光活性化細胞選別を使用した葉

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

蛍光顕微鏡を用いて線虫の中の細菌の可視化

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

ペプチドエピトープの定量分析のための高スループット、MHC II結合アッセイ

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

蛍光標識ナノ粒子を用いたマウス、ヒトおよびブタ起源のライブ細胞の細胞内遺伝子発現の検出

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

の発達過程を追跡し、定量化<em&gt; C。エレガンス</em&gt;オープンソースのツールを使用しました

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

CD4 の分離+ T 細胞および循環の解析 T 濾胞ヘルパー (cTfh) 末梢血を使用して 6 色フローサイトメトリーから細胞のサブセット

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...