我々は、銀粒子の画像をキャプチャするために共焦点顕微鏡を設定するのに援助のためにJ.セッジウィックに感謝、研究資源助成のためのナショナルセンター、NIHの研究助成金AI48484（ATH）、AI20048（RA）、及びAI066314（CJM）によって部分的にサポートされている。 RR00169（CNPRC、カリフォルニア大学、デイビス）。

このメソッドは、で報告された研究で使用されて<a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1726">Li ら、科学 323、1726〜1729（2009） 。</a> その場テトラマー染色やin situハイブリダイゼーション（ISTH）手続きの組み合わせ ISTHの手順は4段階に分けることができます：1）組織中の抗原特異的CD8 + T細胞のISTの染色、2）ウイルス感染 - RNA +細胞を検出するISH、3）IST -染色された細胞の共焦点顕微鏡イメージングとウイルス- RNA +細胞、4）画像解析、画像のモンタージュの建設及び四量体+とウイルスRNA +細胞のマッピングを含む。 1。抗原特異的CD8 +組織切片におけるT細胞のISTの染色。 <ol><li>ビブラトームやメスを用いて200ええと厚の切片に新鮮な組織をカット。 </li><li>チルビブラトームの滅菌PBS - Hが付いている浴室と0-2〜チル℃まではかなり急な27 °にビブラトームブレードの角度を設定します。可能な限り、組織の劣化を最小限にするために、氷上で冷やしておく。新鮮な組織はまた、それを冷やしているときにビブラトームを使用してセクションに簡単です。 </li><li>外科はさみまたは0.25センチの部分で小さく約0.5センチメートルワイドにメスで組織をカット。 〜40で、ボートや小さな皿とカバーの重量を量る° C溶融四パーセントPBSは、アガロースを溶かす低バッファに組織片を置く。組織は、皿の底に接触していることを確認してください。彼らが浮く場合組織片を押し下げ。氷の上で固める。これは通常3-5分かかります。 </li><li>ロックタイトの接着剤でコーティングビブラトーム組織ブロック。鉗子を用いてメス、としているものと組織の周りカットアガロースは、慎重に接着剤でコーティングさビブラトームブロックに壊れやすいアガロース包埋組織を移す。それは組織のブロック上に設定されると、組織片を移動しないでください。氷上で約10分乾燥させます。 </li><li>マウントの組織のビブラトームのブロックとデッドスロー前進速度と比較的高い振幅を使って200um厚の切片に組織を切る。速度と振幅の設定は、各ビブラトームによって異なります。ビブラトームが利用できない場合、または組織の切片ビブラトームに従順でない場合は、メスを用いて細い千切りに組織を切る。 </li><li>冷却したPBS - H 1 mlを入れた24ウェル組織培養プレートのウェルに設定されている組織チャンバーに絵筆を持つセクションを転送する。各組織のチャンバーに4つの組織切片に掲示。実験的なサンプル情報やゴムバンド付きプレートへの安全なフタ付きの組織培養プレートの蓋にラベルを付けます。 </li><li>また、ビブラトームでうまくカットしていない組織のために、腸のように、メスまたはカミソリ刃で可能なストリップ限り薄くカットすることができます。メスカットのセクションでよくごとに1つのセクションを置く。 </li><li>終了最先端の組織の直後に染色に進みます。固定されるまで、すべての回で劣化を最小限に抑えるために冷却セクションを保管してください。セクションが乾燥させないでください。冷却した滅菌PBS - Hのセクションを保管してください。 </li><li>は0.5 mg / mlのFITC結合テトラマーで一晩組織切片をインキュベートします。マウスまたはブロッキング溶液で1:200に希釈したこのインキュベーションの細胞外エピトープに向け非ウサギ抗体、例えば抗CD8抗体を含めることができます。このと後続のすべてのインキュベーションのために、ウェルあたり1 mlのソリューションを使用し、そしてこれと4で、後続のすべてのインキュベーション° Cロッキングプラットフォーム上でプレートとを実行します。後続の手順でソリューションの交差汚染を防ぐためによく空の少なくとも一つで区切られた別の実験試料を含む組織用チャンバーをしてください。 </li><li>主なインキュベーションの後、20分ごとに冷却したPBS - H倍（2X）を持つセクションを洗う。冷却したPBS - Hを含む別の24ウェル組織培養プレートに組織用チャンバーを転送することによりこれを行います。一つの実験サンプルから別に内容を滴下しないように注意して、組織用チャンバーを移動するとき。後続のすべてのインキュベーションおよび洗浄のために同様に適切なソリューションを含むクリーンなプレートに組織用チャンバーを転送する。セクションは、組織用チャンバーの側面に付着しないようにするための手順の間に組織用チャンバー内のセクションを監視します。 </li><li>新しいPBSと修正のセクションでは、室温で2時間4％パラホルムアルデヒドをバッファ。冷PBS - H 2X 5分ごとに洗浄する。 </li><li> 1〜3日のためにブロッキング溶液に、10,000：ウサギ抗FITC抗体、例えばBiodesign1でインキュベートする。共同標識のため、同様にこのインキュベーションで細胞内エピトープに向け非ウサギ抗体を含めることができます。このオプションでは、必要に応じてエピトープを露出させ、前の2回目のインキュベーションの細胞に浸透してブロックする。 </li><li>ホルムアルデヒド固定から抗原賦活化を必要とする細胞内エピトープに向けられた抗体を使用している場合は、電子レンジで、10秒、0.01M尿素で3回煮沸することにより、各時間のエピトープを公開。それぞれの加熱の間に2分間待ちます。沸騰溶液がウェルからセクションを強制的にできるので非常に注意してください。この問題が発生した場合は、ペイントブラシを使用してください適切な組織チャンバーの底に再び組織チャンバーの側面から、またはプレートの蓋からセクションをプッシュする。抗体は必要としない場合、抗原の検索は、この手順を省略します。 </li><li>前の2回目のインキュベーションに、細胞内エピトープに特異的な抗体を使用している場合は、PBS - Hが0.3％トリトンX - 100、および一時間の2％正常ヤギ血清を含むで組織切片でpermeabolizeとブロックの細胞。 、0.3％トリトンX - 100、2％正常ヤギ血清を含むPBS - Hの残り​​の抗体のインキュベーションを行います。 </li><li> 2回目のインキュベーションの後、数時間〜20分間、PBS - Hでセクションを洗う。 3回の洗浄の合計のために二度繰り返します。適切な蛍光標識抗体との最後のインキュベーションを行います。例えば、ヤギの抗ウサギCy3およびヤギ抗マウス-アレクサ488ブロッキング溶液で1:1000それぞれを希釈。 1〜3日間インキュベートする。光消光蛍光団として、その後このインキュベーション中にスズ箔でプレートをラップし、することにより、光から保護されたセクションを保管してください。 </li><li>数時間〜20分間、PBS - Hでセクションを洗ってください。 3回の洗浄の合計のために二度繰り返します。 </li><li> ISHポストフィックスのセクションの場所で安全な四量体と抗体の1時間、4％パラホルムアルデヒドでポストフィックスを組み合わせたISTの場合は、再度とマウントPBS - Hを持つセクションをすすいでください。 </li><li>顕微鏡スライドにセクションを転送するために絵筆を使用。グリセロール/ゼラチンを含む4mg/ml n -プロピル没食子酸やカバースリップで蛍光体の防腐剤とカバーを含むその他の固定メディアでコーティング各セクション。 -20℃での光保護スライドのコンテナに保管してスライド。組織培養プレートに洗い、アルコールで蓋にラベルを削除します。プレートを再利用することができます。 </li><li>共焦点顕微鏡で染色した組織切片を分析する。その後、ISHに進むことができます。 </li></ol> 2。 in situハイブリダイゼーションによるウイルス感染- RNA +細胞を検出する。 in situハイブリダイゼーションプロトコルのこれは、次のように4,5私たちの以前に発行されたプロトコルから変更されました。 <ol><li>再カット5〜8ミクロンの厚sectionss現場テトラマー染色切片の厚さから。 <ol><li> 200ミクロン厚の切片は、℃で5分間のスライドからセクションを分離するために70で加熱されています。 </li><li>セクションは、ドライアイス上で、OCTで埋め込まれています。 </li><li> 8ミクロンの切片厚の切片からクライオスタットで切断し、シラン処理したスライドに付着されています。 </li><li>スライドは、-80℃で保存できますin situハイブリダイゼーション、その後のために密封されたボックスにC。 </li></ol></li><li> in situハイブリダイゼーション<ol><li> 90％エタノール及びDEPC処理水に3分ごとにスライドを浸漬することにより、組織切片を再水和。 </li><li> ℃の水浴中で15分間98℃10mMのクエン酸緩衝液（pH6.0）中で加熱して組織切片を透過処理。 </li><li> 20〜30分間室温でクールな組織切片。 </li><li> 3分間のDEPC処理水で2回洗浄する。 </li><li> 10分間、0.1 M TEA（トリエタノールアミン、pH8.0）の0.25％無水酢酸にスライドを浸漬することにより組織切片をアセチル化する。 </li><li> 5分間0.1 MのTEA液（pH8.0）にスライドを移す。 </li><li> 35 Sで標識したウイルス特異的（例えば、HIV - 1など、SIV）アンチセンスプローブまたはセンス（HIV - 1のネガティブコントロール、SIV）、または35 S -標識LCMVのリボプローブ（プールされたセンスおよびアンチセンス）のセクションをハイブリダイズさせる。 </li><li> 42℃で一晩ハイブリダイゼーション後の5分℃で2xSSCで二回セクションを洗う</li><li> 5分間のSTEのセクションを（0.5MのNaCl、1mMのEDTA、20mMトリス- HCL、pH7.5）で洗浄する。 </li><li> 37 RNaseにSTEのとT1とのセクションを消化℃で30分間</li><li> 2 × SSCでのセクションに加えて5分間、50％ホルムアミドを洗ってください。 </li><li> 1 × SSCで10分間のセクションを洗ってください。 </li><li> 0.5 × SSCで15分間のセクションを洗ってください。 </li><li> 70のセクション、80と0.3 Mの酢酸アンモニウム、各5分を含む100％エタノールを脱水する。 </li><li>核トラックのエマルジョンでコーティングのセクション</li><li> 1時間暗い部屋で乾かしてください。 </li><li> 4でセクションを公開° C 11日目（SIV）と3日間（LCMV）のため。 </li><li> 3分間（コダック、猫＃146 4593）D19のセクションを開発、dH2O 30秒で洗って、4分間（コダック、猫＃146 4106）ラピッドフィクサーで修正、dH2O 5分× 3回洗浄する。 </li><li> 70％、80％と無水エタノール、5分ごとに水分を取り除く。 </li><li>蛍光互換性のあるPermount媒体のマウントスライド。 </li></ol></li></ol> 3。共焦点顕微鏡像を取得する。 <ol><li> Bio - Rad社MRC 1000年共焦点顕微鏡、またはEpi2 -ブルー反射装置を持つ他の共焦点顕微鏡でISTH画像をキャプチャ。 </li><li> 20倍（SIV）または60倍（LCMV用）で、赤四量体蛍光色素用Epi1 - 605、緑CD8蛍光色素用Epi2 - 522 DF32を使用し、銀粒子についてEpi2 -ブルーリフレクション（開発radioautographsのISHシグナル） </li><li>順番に各フィールドの3つのチャンネルで1ミクロンの間隔でZ -シリアルの画像を収集する。 </li><li>左からの各セクションから画像を取得する右、および上から下へ、およびExcelファイルでその行や列に基づいて各画像に名前を付けます。 </li><li>再構成されたモンタージュ画像のギャップを避けるために、隣接画像との〜20％オーバーラップで各イメージをキャプチャします。 </li></ol> 4。画像解析：モンタージュ画像再構成、細胞重心計算と空間分析。 <ol><li>プロジェクトZ -シリアル画像共焦点アシスタント（バージョン4.02）で、チャネルごとに単一のイメージに。 </li><li>自動的にPhotoshop 7.0のアクションの手順を使用して、1つのRGB画像に3つのチャンネルから投影されたイメージをマージする。 </li><li> Photoshop 7.0でのレイヤーで一緒にマージされた画像をつなぎ合わせによるモンタージュ画像を生成する。 </li><li>准個々の銀粒子と四量体は、細胞と染色、およびMetaMorph（バージョン7.1.3）またはPhotoshopを（筆者から入手可能）を使用してX、SIV RNA +と四量体+セルの中心のY座標を（重心）、割り当てる</li><li>各セルの数値の数字としてExcelファイルに重心データをエクスポートします。 E：T比がセクションの四量体の合計数字+およびウイルスRNA +細胞からのE​​xcelファイルから決定されています。 </li></ol>赤四量体+と青SIV RNAとの間の空間的関係は、+細胞は、PhotoshopのドキュメントにExcelファイルから、それぞれのプロットをコピーして貼り付けることによりキャプチャされます。彼らは色を選択すると青RNA +細胞の位置をコピーして新しいレイヤーにペーストする、一致するようにグリッドを調整し、スケーリングするレイヤーの不透明度を減少した後、次にグリッドを揃えるために使用される廃棄層、位置四量体の+とウイルスRNAの+細胞は、統合された画像で明らかにされます。 5。追加の注意事項感染組織を切断する場合： BSL2.5ラボで働く。カミソリの刃を持つ特別な予防策を講じる。鉗子でビブラトームブレードマウントにカミソリを置く。あなたが鉗子とでブレードを置くことができない場合は、お風呂に組織を追加する前にそれを入れ、刃を交換しないでください。終了したら切断する場合には、鉗子で刃を取り外します。除去前〜70％エタノールまたはDMQでスプレーブレード。いつものように、鋭利物容器のブレード処分する。外側の手袋を変更したり、組織またはタンク内の汚染されたPBSで各接触後に消毒剤ですすいでください。終了したら、感染性物質を扱う場合、タンク内にPBSにDMQの消毒剤を追加し、電源を切って数分放置します。どぶ除染PBS廃棄してください。その後、塩と消毒剤を除去する水でタンクを洗う。 DMQクリーンなワークスペースや調理器具。水で食器を洗います。 ビオチン化MHCモノマーから四量体を確認するには： 私はこのようなHLA - A * 0201 / B 2としてベックマンコールター社からギャグ（SLYNTVATL）、ポル（ILKEPVHGV）、または無関係MARTペプチド（ELAGIGILTV）ペプチドのいずれかで生成されたM /ペプチド分子を分子ビオチン化MHCクラスを取得します。ビオチン化HLA - A * 0301 / B 2 M /ペプチドNIAIDテトラマー施設でギャグ（KIRLRPGGK）またはネフ（QVPLRPMTYK）のいずれかで生成された分子。四量体は、FITC標識の6アリコートを添加することにより生成されるビオチン化麻木にExtraAvidin（シグマ）* 01 / B 2 M / 4.5:1の最終的なモル比に8時間の経過とともにペプチドモノマー。ゆっくりExtravidinを追加する論理的根拠は、初期の時点の間に追加さExtravidinのすべてがバインドされているすべての4つのビオチンのサイトを取得することを保証する単量体の過剰があるということです。 ExtrAvidinがバインドされているすべての4カ所を持っていないことにチャンスの少ないモノマーと左よりあるので、後で反応で、このプロセスは非効率的です。 ExtrAvidinのすべてを一度に追加し​​た場合は反応が少なく、効率的でより多くのExtravidin分子が接続されている唯一の2つまたは3つのモノマーを持っているということです。

<ol>
	<li>Altman, J. D., Moss, P. A. H., Goulder, P. J. R., Barouch, D. H., McHeyzer-Williams, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li><li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting Edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> Journal of Immunology. 165, 617-61 (2000).</li><li>Qingsheng, L. i., Skinner, P. J., Ha, S. -. J., Duan, L., Mattila, T., Hage, A., White, C., Barber, D. L., O'mara, L., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcome+in+early+viral+infection.">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcome in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2008).</li><li>Haase, T., Haase, K., Zupancic, M., Sedgewick, G., Faust, R. A., Melroe, H., Cavert, W., Gebhard, K., Staskus, K., Zhang, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perelson+Quantitative+Image+Analysis+of+HIV-1+Infection+in+Lymphoid+Tissue.">Perelson Quantitative Image Analysis of HIV-1 Infection in Lymphoid Tissue.</a> Science. 274, 985-989 (1996).</li><li>Li, Q., Duan, L., Estes, J. D., Ma, Z. M., Rourke, T., Wang, Y., Reilly, C., Carlis, J., Miller, C. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+SIV+replication+in+resting+memory+CD4+T+cells+depletes+gut+lamina+propria+CD4+T+cells.">Peak SIV replication in resting memory CD4 T cells depletes gut lamina propria CD4 T cells.</a> Nature. 434, 1148-1152 (2005).</li><li>Li, Q. i. n. g. s. h. e. n. g., Estes, J. a. c. o. b. D., Schlievert, P. a. t. r. i. c. k. M., Duan, L. i. j. i. e., Brosnahan, A. m. a. n. d. a. J., Southern, P. e. t. e. r. J., Reilly, C. a. v. a. n. S., Peterson, M. a. r. n. i. e. L., Schultz-Darken, N. a. n. c. y., Brunner, K. e. v. i. n. G., Nephew, K. a. r. l. a. R., Pambuccian, S. t. e. f. a. n., Lifson, J. e. f. f. r. e. y. D., &amp;amp, J. o. h. n. V. C. a. r. l. i. s., Haase, A. s. h. l. e. y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+monolaurate+prevents+mucosal+SIV+transmission.">Glycerol monolaurate prevents mucosal SIV transmission.</a> Nature. , (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ウイルスRNAは、本報告書におけるウイルス感染細胞のマーカーとして使用されているため、ハイブリダイゼーションの前にすべての試薬は、リボヌクレアーゼフリーでなければなりません。ここで説明したin situハイブリダイゼーションの手順でその場テトラマー染色での蛍光シグナルを維持するように変更されています。 in situハイブリダイゼーションによって検出されたウイルスに感染した細胞からradioautographic信号が約1セル径の深さにあるため、その場テトラマー染色のために使用される厚さのセクションでは5 - 8 -ミクロン厚の切片に改修さでなければならない。 その場四量体にし、in situハイブリダイゼーション（ISTH）の組み合わせのこの斬新な手法では、ウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染標的細胞の空間的関係の同時可視化、マッピングおよび分析を可能にするここで説明する。このメソッドは、CD8を評価するために+ T細胞をワクチンベースおよびその他の非ウイルスの病原体と宿主の相互作用に適用することができます。画像解析の手法も、その場で相互作用する任意の2つの細胞集団、例えば、の空間的な関係を研究するために適合させることができる我々は最近、サル免疫不全のヒト以外の霊長類モデルでのHIV - 1の性的感染を研究する上で重心のマッピングの手順を使用ここで説明アカゲザル6のウイルス感染

ソリューションと試薬： <ul><li> PBS - Hのリン酸塩はRNaseを阻害するために生理食塩水を含むヘパリン（100ug/mlまたは18.7U/ml）をバッファ</li><li> RNaseを阻害するためにヘパリン（100ug/mlまたは18.7U/ml）を含むRPMIの組織培養培地</li><li> 4パーセントPBSの低融点アガロース</li><li> 2パーセント正常ヤギ血清（または蛍光標識抗体が行われた種からの血清）を含むPBS。 </li><li> 2パーセント正常ヤギ血清、0.3％トリトンX - 100を含むPBS </li><li> MHCクラスIは、FITCコンジュゲートさテトラマー</li><li>抗FITC抗体、例えばBioDesignウサギ抗FITC </li><li>高度に複数のラベル、たとえばヤギ抗ウサギ- Cy3で使用するために他の種のIgGに吸着クロスされている蛍光物質結合抗ウサギIgG </li><li>高度に複数のラベルで使用するために他の種のIgGに吸着クロスされている蛍光物質結合抗マウスIgG </li><li>新鮮なPBSは、4％パラホルムアルデヒドをバッファ</li><li> 0.01M尿素</li><li>グリセロール/ゼラチンを含む4mg/ml n -プロピル没食子酸</li></ul>特別な機器<ul><li>ビブラトーム</li><li>外科用メス</li><li>剃刀の刃</li><li>外科はさみ</li><li>ロックタイトクイックセット瞬間接着剤（製品＃46551） </li><li>鉗子</li><li> ＃2、ラクダの毛のペイントブラシ。所望の厚さにカミソリの刃でトリミングすることができます</li><li> 24ウェル平底組織培養プレートなどファルコンカタログ＃353226 </li><li>組織用チャンバー</li><li>スズ箔</li><li>段ボールスライドのフォルダなどフィッシャーカタログ＃12-587-10 </li><li>共焦点顕微鏡</li></ul> ISTの試薬のクイックリファレンス PBS - H（リン酸ヘパリンと緩衝生理食塩水） <ul><li> 450ミリリットル1X PBS </li><li> 50 mlの1X PBS + 10Xヘパリン</li></ul> 1 × PBS + 10Xヘパリン<ul><li> 500ミリリットル1X PBS </li><li> 500mgのヘパリン粉末（ドライケミカルストレージシェルフ上にある） </li></ul> PBS - H / 2％NGS（正常ヤギ血清） <ul><li>ファルコンチューブの49 mlのPBS - H </li><li> 1 mlのNGS（-20冷凍庫に1mlのアリコートに見られる） </li></ul> PBS - H / 2％NGS / 0.3％トリトンX - 100 <ul><li>ファルコンチューブの49 mlのPBS - H / 0.3％トリトンX - 100 </li><li> 1 mlのNGS（-20冷凍庫に1mlのアリコートに見られる） </li></ul> PBS - H / 0.3％トリトンX - 100 <ul><li> 500ミリリットルPBS - H </li><li> 1.5ミリリットルトリトンX - 100（これは、ドライケミカルストレージシェルフ上にある濃厚な液体です。） </li></ul> 4パーセントLMPアガロース<ul><li> 2グラムLMPアガロース粉</li><li> 50ミリリットルのPBS </li><li>粉が溶けるまで混合、電子レンジまで振る。 </li></ul> GG - NPG（n -プロピルgalateとゼラチングリセリン<ul><li>溶けて50度の水浴中にグリセロールゼラチンの瓶を置きます</li><li>プロピルgalate（テリスの棚にある）の0.06 gを追加し、よく振る</li><li>溶けるまで時々振り、水浴してください。 </li><li> 1 mlのチューブ（茶色のチューブ）に分注し</li></ul> 4％パラホルムアルデヒド<ul><li> 4gのパラホルムアルデヒド粉末（ドライケミカルストレージシェルフ上にある） </li><li> 10をメスシリンダーでmlのPBS - H言いふらすPFパウダーを追加</li><li>ボリュームは約70 mlを達するまで少し水を加える</li><li> NaOHのいずれかのスポイトを追加。 </li><li> （通常約20〜30分）に溶解するまで攪拌</li><li> pHが7-8の間に達するまで塩酸を追加。 </li><li>水で100mlにボリュームをもたらす。 </li></ul>尿素0.01 M <ul><li> 0.3グラム尿素（ドライケミカルストレージシェルフ上にある） </li><li>水500ml </li></ul>

a technique to simultaneously visualize virus-specific cd8+ t cells and virus-infected cells in situ

それらの感染細胞のターゲットの番号と場所への相対的な数字と場所のウイルス特異的CD8 + T細胞が隙間から慢性的な永続的な感染症の範囲という結果を決定する上で非常に重要であると考えられている。ここでは、ウイルス特異的CD8 + T細胞を検出するためにその場四量体（IST）染色とin situで結合した免疫エフェクター（E）ウイルス特異的CD8 + T細胞と感染のターゲット（T）の間の空間的および定量的な関係を評価するための方法を説明します。免疫防御と感染の間に戦いが行われる組織ではウイルス- RNA +細胞を検出するハイブリダイゼーション（ISH）。 T比：ISTの染色とISHの組み合わせ、簡略ISTHは、免疫エフェクター細胞とターゲット、およびEの安易な決定の位置の可視化とマッピングが可能になります。順番にこれらのパラメータは、空間的近接性、および初期の感染の転帰を予測する免疫応答のタイミングと大きさの関係を決定するために使用することができます。

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A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

その場テトラマー染色やin situハイブリダイゼーション（ISTH）で組み合わせる手法は可視化、マッピングおよび分析、そのウイルスに感染したターゲットへのウイルス特異的CD8 + T細胞の空間的な近接性の、及びこれらの免疫エフェクターと標的の間の量的関係を決定することが可能に感染の結果に。

同時にウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

a-technique-to-simultaneously-visualize-virus-specific-cd8-t-cells

Research

JoVE Journal

Biology

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

12.0K ビュー.  University of Minnesota. その場テトラマー染色やin situハイブリダイゼーション（ISTH）で組み合わせる手法は可視化、マッピングおよび分析、そのウイルスに感染したターゲットへのウイルス特異的CD8 + T細胞の空間的な近接性の、及びこれらの免疫エフェクターと標的の間の量的関係を決定することが可能に感染の結果に。

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Regulatory T cells: Therapeutic Potential for Treating Transplant Rejection and Type I Diabetes

制御性T細胞：移植拒絶反応とI型糖尿病を治療するための治療の可能性

生物学

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

骨髄の造血細胞のホーミング

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

接着および非接着性の哺乳動物細胞の in situ細胞下分画で

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

弁内皮細胞の単離

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

クローン原性アッセイ：付着細胞

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

レーザーUncagableフルオレセインデキストランでゼブラフィッシュ細胞の系統ラベリング

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

筋幹細胞におけるオートファジーのin situ Immunofluorescent Staining

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...