この作品は、NIHの助成金R01-GM-098977およびCBKとKEGにR 21-AI-098122によってサポートされていました。 RSSは、工学部のセイヤースクールセイヤーイノベーションプログラムフェローシップによってルース財団フェローシップにより部分的には部分的にサポートされていました。

1結合：四大活動は、ペプチド-MHC II結合アッセイを含み、試験ペプチドは、可溶性MHC IIタンパク質の結合溶液相に対する標識対照ペプチドと競合する。結合は、試験ペプチド濃度の広い範囲にわたって測定される。 2 - キャプチャ：結合反応が平衡に近づく後、ペプチド-MHC II複合体を捕捉し、固定化された抗体とのコンフォメーション依存認識による未結合のペプチド及び蛋白質から分離される。 3 - 検出：キャプチャコントロールペプチドを定量的に時間分解蛍光を用いて検出される。 4 - 分析：分光データは、処理されたプロットし、試験ペプチド及びMHC IIタンパク質の用量依存的な結合特性を確認するために分析される。 1が利用可能な場合、以下の手順の様々なステップでは、液体ハンドリングロボットの使用が推奨されます。特に、384ウェル形式で、液体の自動分配および希釈は、ユーザエラーを最小にする、より詳細な結果ウェル間のボリューム一貫性、および手動96ウェルアッセイ（データは示していない）と比較してIC 50値に対する下位95％信頼区間が得られる。液体処理ロボットが使用できない場合、「（液体処理ロボット）」で注釈工程は手作業で行われてもよい。可能な場合は同様に、384ウェルフォーマットと互換性のある自動プレート洗浄機をお勧めします。これは事実上、プレート洗浄プロセスを標準化しています。プレート洗浄機を使用できない場合は、「（プレートウォッシャー）」で注釈工程は手作業で行われてもよい。 1。コー​​トELISAプレート（1日目） <ol><li>希L243抗体ストック（0.5 mg / ml）をホウ酸緩衝液中の10μgの/ mlの作業濃度である。 <ol><li>シングル384ウェルプレートをコーティングする、ホウ酸緩衝液9.8ミリリットルに株式抗体を200μlを加える。 （代替スケーリングのための補助的なスプレッドシートの計算機を参照してください）​​。 </li></ol></li><li> 384-Wの各ウェルにL243抗体溶液25μlを追加エル白ELISAプレートを高結合。 （液体ハンドリングロボット） </li><li>ポリエステルフィルムでプレートを密封し、4℃で一晩インキュベート 注：各384ウェルELISAプレートは、15テスト1 MHC II対立遺伝子に8希釈でペプチドだけでなく、正と負の対照まで収容することができます。これは最終的に三連の測定値が得られる。 </li></ol> 2。試験ペプチド希釈（1日目）を作る<ol><li> DMSO中の各試験ペプチドの10mMストックから開始し、384ウェルポリプロピレンプレート（ 表1）を用いてクエン酸リン酸緩衝液で以下の希釈系列を作る。 （液体ハンドリングロボット） 注：完全な384ウェルポリプロピレンプレートは、3つの別々のELISAプレートを必要とする。ポリプロピレン板の3分の1は唯一のELISAプレート（ 図1）が必要になります。 </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2">希釈番号</td><td>ボリュームタイプTO希釈前/在庫から取る</td><td>追加するボリュームクエン酸緩衝液</td><td>コンク。希釈液</td><td>コンク。結合反応中</td><td>コンク。中和さELISAにおける</td></tr><tr><td> （μL） </td><td> （μL） </td><td> （μM） </td><td> （μM） </td><td> （μM） </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.7 </td><td> 35.1 </td><td> 195.531 </td><td> 97.765 </td><td> 48.883 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 97.765 </td><td> 48.883 </td><td> 24.441 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7.1 </td><td> 28.7 </td><td> 19.389 </td><td> 9.695 </td><td> 4.847 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 9.695 </td><td> 4.847 </td><td> 2.424 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 7.1 </td><td> 28.7 </td><td> 1.923 </td><td> 0.961 </td><td> 0.481 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 0.961 </td><td> 0.481 </td><td> 0.24 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 7.1 </td><td> 28.7 </td><td> 0.191 </td><td> 0.095 </td><td> 0.048 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 0.095 </td><td> 0.048 </td><td> 0.024 </td></tr><tr><td colspan="6">希釈番号8からペプチド溶液7.1μLを取り外し、廃棄します。 </td></tr></tbody></table> 表1試験ペプチド希釈系列の調製 。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1.jpg" /> 図1のペプチドマップは、ポリプロピレン384ウェルプレート中のペプチド希釈液のアッセイ（A）地図結合プレート 。各ポリプロピレン板が歌うに対する競合結合反応で15ペプチドの3グループを収容することができます<html>ルMHC II対立。結合反応が平衡に近づくと（B）、各ペプチド群は、抗MHC II抗体でプレコートされた別々の384 -ウェルELISAプレートに、三連で、転送される。 3。 MHC IIマスターミックス（1日目）を準備<ol><li>反応バッファーを作る<ol><li>クエン酸リン酸緩衝液3920μlに1 mMのPEFA圏の80μL及びオクチル-β-D-glucopyranaside 60mgのを追加します。 （代替スケーリングのための補助的なスプレッドシートの計算機を参照してください）​​。 </li></ol></li><li> 15ミリリットルコニカルチューブを使用して反応緩衝液中で101 nMである（ 表2）に選択されたMHC II原液を希釈します。 注：MHC II濃度が最終的に結合反応し、中和ELISAアッセイで25 nMで50 nmとなります。 MHC IIストック濃度は、製造者のロット番号に依存して変化する。 （補足スプレッドシートの計算機を参照してください）​​。 </li></ol>&quot;&gt; <tbody><tr><td> MHC IIアレルDRB1 *： </td><td> 1501 </td></tr><tr><td> MHC IIストック濃度（mg / ml）を</td><td> 1.3 </td></tr><tr><td> MHC IIのストック濃度（MM） </td><td> 20 </td></tr><tr><td>巻（ml）を追加するには、MHC II証券</td><td> 14.65 </td></tr><tr><td>巻（ml）を追加するために反応バッファー： </td><td> 2885.35 </td></tr><tr><td> MHC IIマスターミックス濃度（NM） </td><td> 101 </td></tr></tbody></table> 表2。MHC IIマスターミックスの調製。 4。陰性および陽性対照（第1日）を準備<ol><li>ステップ2.1から384ウェルポリプロピレンプレート（ 図1A）の「負の対照」ウェルにクエン酸リン酸緩衝液21.5μLを加える。 </li><li> 384ウェルポリプロピレンプレートの「陽性対照」ウェルにクエン酸リン酸緩衝液21.5μLを加える。 注： &quot;POSITIVEコントロール」は、以下、セクション5で完了します。 </li><li> 1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブにステップ3.2およびピペットからMHC IIマスターミックスの49.5μLを削除します。 </li><li>ステップ4.3からMHC IIマスターミックスの49.5μlにクエン酸緩衝液0.5μLを加える。 </li><li> 384ウェルポリプロピレンプレートの「負の対照」ウェル（ 図1A）、ステップ4.4からMHC IIマスターミックスを調整する濃度の21.5を添加する。 注：このサンプルは、MHC IIタンパク質、NOコントロールペプチド、お​​よびNO試験ペプチドを含む、ゼロ信号ネガティブコントロールを表す。 </li></ol> 5。適切なコントロールペプチドは、MHC IIマスターミックス（1日目）に追加<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> MHC IIアレルDRB1 * </td><td>ビオチン化対照ペプチド</td><td> （残基） </td><td>シーケンス</td></tr><tr><td> 0101 </td><td>インフルエンザHA-B </td><td> （306から318） </td><td>ビオチン - （AHX）（AHX）PRYVKQNTLKLAT - アミド</td></tr><tr><td> 0301 </td><td>ミオグロビン</td><td> （137-148） </td><td>ビオチン - （AHX） - （AHX） - LFRKDIAAKYKE-OH </td></tr><tr><td> 0401 </td><td> YAR-B </td><td> （1-14） </td><td>ビオチン - （AHX）（AHX）YARFQSQTTLKQKT-OH </td></tr><tr><td> 0701 </td><td> TetTox-B </td><td> （830から843） </td><td>ビオチン - （AHX）（AHX）QYIKANSKFIGITE-OH </td></tr><tr><td> 1101 </td><td>インフルエンザHA-B </td><td> （306から318） </td><td>ビオチン - （AHX）（AHX）PRYVKQNTLKLAT - アミド</td></tr><tr><td> 1501 </td><td> MBP-B </td><td> （84から102） </td><td>ビオチン - （AHX）（AHX）NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH </td></tr></tbody></table> *私たちは、経済のために10mgのスケールをご注文をおすすめします。 表3。様々なMHC II対立遺伝子の制御ペプチド。* <ol><li> 20100μMで希釈されたストックを得るために、新鮮なDMSOにコントロールペプチド（DMSO中400μMのに格納されている）1:20に希釈する。 <ol><li> 25μMの400μlの対照ペプチドを追加475μLのDMSO。注：これは大過剰であるが、粘性のDMSO溶液の正確なハンドリングを可能にします。 </li></ol></li><li>さらに、ステップ3.2からMHC IIマスターミックスにステップ5.1からのコントロールペプチド（20 mM）を1:100に希釈する。 <ol><li> MHC IIマスターミックスの残りの2,850.5μlにステップ5.2に希釈したコントロールペプチドの28.8を添加する。 </li></ol></li><li> 384ウェルポリプロピレンプレート（ステップ4.2）（ 図1A）の陽性対照ウェルに対照ペプチド（ステップ5.2）で、MHC IIマスターミックスの21.5を添加する。注：このサンプルは、MHC IIタンパク質、コントロールペプチド、お​​よびNO試験ペプチドを含む高信号ポジティブコントロールを表します。 </li></ol> 6。結合反応（1日目）を作る<ol><li>結合反応を作成するには、1:1の比率で試験ペプチド希釈液（ステップ2.1）のそれぞれにコントロールペプチド（ステップ5.2）を含むMHC IIマスターミックスを追加します。 <ol><li>コンを含むMHC IIマスターミックスの21.5μLを追加ステップ2.1から各テストペプチド希釈の21.5μlにステップ5.2からペプチドをTROL。 （液体ハンドリングロボット） </li></ol></li><li>ポリエステルフィルムとの結合反応を密封し、振とうせずに37℃でのCO 2以外の制御インキュベーター内で12月24日時間インキュベートする。 </li></ol> 7。結合反応（2日目）を中和し、転送<ol><li> 37℃のインキュベーターから結合反応（ステップ6.2）を含む384ウェルポリプロピレンプレートを取り外します。 </li><li>中和バッファーとの結合反応1:1に希釈する。 （液体ハンドリングロボット） <ol><li>各ウェル結合反応を中和バッファーの43を添加する。 </li></ol></li><li> 4℃からELISAプレート（ステップ1.3）を取り外し、PBS-0.05％トゥイーン20の60ミリリットル/ウェルで3回洗浄します。 （プレートウォッシャー） </li><li>転送ステップ7.3からの抗体でコーティングされた384ウェルELISAプレートの三重ウェルにステップ7.2から、各中和結合反応の25μlの。 （ 図1 </強い&gt;）（液体処理ロボット） </li><li>一晩2.5時間37℃のインキュベーター内または4℃の冷蔵庫でポリエステルフィルムと場所でELISAプレートをカバーしています。 </li></ol> 8。 ELISA法の開発（2日目または3） <ol><li>ステップ7.5からELISAプレートを外し、60μL/ウェルのPBS-0.05％Tweenで3回洗浄する。 （プレートウォッシャー） </li><li> DELFIAアッセイ緩衝液中でストレプトアビジン-ユーロピウム保存溶液（0.1 mg / mlのストレプトアビジン、7のEu 3 + /ストレプトアビジン）千倍に希釈します。 <ol><li> 1 384ウェルプレートの場合は、10ミリリットルアッセイバッファーに10μlのストレプトアビジン - ユーロピウムを希釈。 </li></ol></li><li>ステップ8.1から384ウェルELISAプレートの各ウェルに希釈したストレプトアビジン - ユーロピウムの25を添加する。 （液体ハンドリングロボット） </li><li> 1時間室温で暗所でのポリエステルフィルムと場所でプレートをカバーしています。注意：1時間のインキュベーションの間、冷蔵庫から増強溶液を削除し、ROで暗所に10ミリリットル/プレート取っておくomの温度。 </li><li> 1時間のインキュベーションに続いて、60μL/ウェルのPBS-0.05％Tweenでステップ8.3 3Xから384ウェルELISAプレートを洗う。 （プレートウォッシャー） </li><li>ステップ8.5から384ウェルELISAプレートの各ウェルに増強溶液25μlを追加します。 （液体ハンドリングロボット） </li><li>ポリエステルフィルムとの384ウェルELISAプレートを被覆し、プレートを10〜15分間室温で暗所で静置する。 </li><li> 200、ストップ：INT：1,000、例340は、EM 10〜15分インキュベートした後、時間例えばユーロピウム設定で分解蛍光プレートリーダー（スタート、intを使用してステップ8.7から384ウェルELISAプレートの蛍光を読む。615、カットオフ：なし、PMT：オート/ウェル読み取ります。50）。 </li></ol> 9。データ解析<ol><li>サイド·バイ·サイドの列の3反復値（、Y =蛍光測定、X =試験ペプチド濃度）でのXY形式のグラフのデータを入力してください。 </li><li> X =ログ（X）：ログには、すべてのデータのためのX値を変換する</li><li>ログTRAにフィットIC 50値を抽出するために、1部位競合結合モデルにデータをnsformed。 </li><li>平均ネガティブコントロール値にボトム値を制約する。 </li><li>グローバルトップ値にフィットし、グローバルフィットパラメータは下記、または陽性対照と同等であることを保証する。 </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+genomics+and+immunoinformatics+to+produce+improved+vaccines.">Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines.</a> Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).</li><li>Sturniolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tissue-specific+and+promiscuous+HLA+ligand+databases+using+DNA+microarrays+and+virtual+HLA+class+II+matrices.">Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices.</a> Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologic+drugs+set+to+top+2012+sales.">Biologic drugs set to top 2012 sales.</a> Nat. Med. 18, 636 (2012).</li><li>Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+vaccines+in+the+era+of+genomics:+a+decade+of+reverse+vaccinology.">Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology.</a> Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).</li><li>Jiang, W., Boder, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+engineering+and+analysis+of+peptide+binding+to+class+II+MHC.">High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).</li><li>Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -. L. B., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recombinant+MHC+class+II+molecules+and+high-throughput+peptide-binding+assays.">Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays.</a> Immun. 5, 1-20 (2009).</li></ol>

レナードモイーズはによって採用さEpiVax社、プロビデンス、ロードアイランドに位置して個人所有のバイオテクノロジー企業でストックオプションを保持している。この調査報告書に含まれている仕事は、企業の商業目的に関連付けられる可能性の偏りがない。

バイオ医薬品は、2012年32でトップ5の販売薬の4を表す、現代医学の礎としての地位を確立している。生物薬剤学部門は数年前から6のために持続的な成長を示しており、新規薬剤の継続的な開発だけでなく、バイオシミラーの出現は、バイオ医薬品のパイプラインを拡大してきました。将来的に見ると、タンパク質治療薬の免疫原性を評価し、軽減することは、初期段階の生物...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.
Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
to:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 &#181;g of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
Step 5.2&#160;in the Protocol was updated from:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
to:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 &#181;M) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
Table 2 was updated from:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mM)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (ml)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (ml):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (&#956;M)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (&#956;l)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (&#956;l):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.

Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

タンパク質は、治療薬6の最も急成長しているクラスであり、生物学的治療のパイプラインの急速な拡大は、タンパク質薬剤の開発および使用に関連した課題にますます注目が集中している。 One固有の考慮事項は、健康で機能する免疫系では、全ての細胞外タンパク質は、抗原提示細胞（APC）によってサンプリングされるという事実から生じる。一旦APCにより内部移行、タンパク質は、小ペプチドフラグメントに切断され、推定上の免疫原性のセグメントは、クラスII主要組織適合複合体タンパク質（MHC II）の溝にロードされる。ペプチド-MHC II複合体は、次いで、APCの表面に表示され、真の免疫原性ペプチドは、同族のCD4 T細胞表面受容体7との三元MHC II-ペプチド-T細胞受容体複合体を形成し、T細胞エピトープと呼ばれる。この臨界分子認識事象は、T細胞活性化をもたらす複雑なシグナル伝達カスケード、サイトカインの放出を開始するS、CD4 T細胞媒介B細胞の成熟とに結合して、問題のある外因性タンパク質をクリアしたIgG抗体を循環させる、最終的に生産。このように、免疫原性タンパク質は、構成のT細胞エピトープを同定およびMHC II複合体形成の原因の重要な残基を変異させることにより脱免疫化される可能性があります。これは、T細胞エピトープは、多数の広く免疫原性タンパク質全体に分散することができることは、注目に支持、およびエピトープ削除突然変異の大部分は、タンパク質機能または安定性の不慮の損失を引き起こす可能性がある。そのため、工学は生物学的療法は複雑で技術的に困難な客観的可能脱免疫が、成功したT細胞エピトープの削除プロジェクト3,5,8-12のいくつかの例が存在する。主に抗体治療薬に限定されている移植ベースの「ヒト化」とは異なり、エピトープの削除は関係なく、配列、構造、機能の本質的に任意のタンパク質標的に適用することも、homologoの可用性私たち人間の足場。このようなアプローチを実装するための最初のステップは、標的タンパク質配列内に埋め込まれた鍵ペプチドエピトープの同定である。 合成ペプチドおよび組換えヒトMHC II分子を用いた高スループット生化学アッセイは、エピトープ同定と緩和1,3-5への迅速な予備的な洞察を提供することができます。これらのELISA型アッセイは、他のタンパク質/ワクチン設計および開発ツールへの強力な補完することができます。例えば、エピトープマッピングに1十分に確立された実験的なアプローチは、時間、労力に依存しており、集中的なex vivoでの細胞増殖アッセイ15リソース 。簡単に言えば、標的タンパク質の一次配列は、最初の重複ペプチドのパネルに分割され、12残基と、多くの場合、15量体は、隣接するペプチドとの間で重複している。ペプチドのパネルは、化学的に合成され、各ペプチドの免疫原性は、Blooの周辺を用いるいくつかの異なるイムノアッセイのいずれかで試験するd個の単核細胞（PBMC）、ヒトのドナーから単離された13,14。検索結果においてより大きな信頼性を提供するために、ペプチドは、典型的には50以上の異なるドナーからのPBMCを使用してレプリケートで試験する。脱免疫化は、究極の目的である場合において、作業が変異したペプチドの追加のパネルを生産し、その後の機能解析10のために、全長タンパク質内の任意の脱免疫化変異を導入する前に、PBMCアッセイにおいて新規なペプチドのパネルを試験する必要性によってさらに悪化する。これらの細胞アッセイは、ヒト患者における免疫原性を評価するためのゴールドスタンダードまま、このような徹底的なアプローチの効率は、迅速かつ高スループットMHC II-ペプチド結合アッセイを用いて推定される免疫原性エピトープをプレフィルタリングすることによって改善される可能性があります。 同様に、生化学的ペプチド-MHC II結合アッセイは、ラジカルエピトープ同定プロセスを加速するためにインシリコにおける予測方法と組み合わせることができる。T細胞エピトープ予測のための計算のさまざまなツールが存在し、その例は、のProPred 16が含まれ、MHCPred 17、SVRMHC 18、ARB 19、20を SMM-揃え、NetMHCIIpan 21だけでなく、EpiVax 22によるこのようなエピマトリックスなどの独自のツール。同様に、エピトープ予測因子は最近、脱免疫変異は、タンパク質の構造と機能23〜26を崩壊させる可能性があるリスクを軽減するために設計された統合タンパク質脱免疫アルゴリズムを得るために、他のバイオインフォマティクスと分子モデリングツールと統合されました。いくつかのエピトープ予測因子が合理的に正確27,28であることが証明されているが、計算結果は、常に実験的な検証が必要。迅速な高スループット、費用効果的な実験方法は、インシリコエピトープ予測内の予備フィルターとして最適です。 同じような文脈では、エピトープ予測因子は、逆vaccinoloための抗原選択を駆動することができますGY 29,30。例えば、バイオインフォマティクスの進歩が急激に病原体プロテオームから抽出された全タンパク質又はペプチドエピトープの形でワクチン候補を同定する全ゲノムスクリーニングをもたらした。これを可能にする技術は、保護ワクチンの発見と開発を再形成されているが、免疫原性のワクチン候補の頑丈に大規模なリストの形で新たな挑戦を紹介します。ハイスループットペプチド-MHC II結合アッセイは、ペプチド結合親和性を定量化し、複数のMHC II対立遺伝子の中で乱雑に結合することによって、エピトープの選択を導くことができる。タンパク質脱免疫を持つように、このような実験方法は、最終的に有望なワクチンリードの計算予測を検証するために必要とされる。 ここで、384ウェルフォーマットにスケーリングされたペプチド-MHC II結合アッセイが記載されている。プロトコルは、高度に並列化され、以前に、96ウェルプレートフォーマット1,3-5記載と比較して75％試薬コストを削減する。シングルリキを使用したDハンドリングロボットは、このメソッドは1研究者が簡単に8濃度未満48 HRの4 MHC II対立遺伝子型の範囲に渡って三連で約90試験ペプチドを分析することができます。この記事では、1 MHC IIアレルに対する7実験ペプチドの分析のための1の384ウェルELISAプレートのセットアップについて説明するが、容易に所望のペプチドおよび/またはMHC任意の数の実験をスケールするように広がったシート電卓は、補足資料として提供されているII分子。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:587px;">Sodium Tetraborate Decahydrate</td>
			<td style="width:357px;">Sigma</td>
			<td style="width:217px;">221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Citric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trizma HCl</td>
			<td>OmniPur</td>
			<td>9310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">100% DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Octyl-&#946;-D-Glucopyranaside</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>29836-26-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Pefa Bloc SCF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1158591600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dulbecco&#8217;s 10X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Assay Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4002-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Enhancement Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4001-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Europium Labelled Streptavidin</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1244-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">L243 anti-HLA-DR antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>307602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Biotinylated tracer peptides</td>
			<td>21st Century Biochemicals</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Test peptides (1-4mg, 85% purity)</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated)</td>
			<td>Benaroya Research Institute*</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">384-well white EIA/RIA plate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>460372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Polypropylene 384-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Film, AxySeal, 80 &#181;m, ELISA Applicator&#160;</td>
			<td>Axygen Asicentific</td>
			<td>PCR-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">MilliQ Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Epimotion Liquid Handler (or similar)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Select TS Plate Washer (or similar)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="98" style="height:99px;width:1161px;">*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory. See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high throughput mhc ii binding assay for quantitative analysis of peptide epitopes

組換えヒトMHC II分子と生化学的ア ​​ッセイは、免疫原性エピトープ同定、削除、またはデザイン1,2に迅速かつ定量的な洞察を提供することができます。ここでは、ペプチド-MHC II結合アッセイを、384ウェルフォーマットにスケーリングされる。縮小されたプロトコルは、75％の試薬 ​​コストを削減し、以前に、96ウェル·プロトコル1,3-5記載よりも高いスループットである。具体的には、実験的なデザインは、384ウェルELISAプレートにつき1 MHC IIアレルに対して最大15のペプチドの堅牢で再現性のある分析が可能。単一液体処理ロボットを用いて、この方法は、1つの研究者が、48時間未満の8濃度四II MHC対立遺伝子型の範囲にわたって三連で約90試験ペプチドを分析することができます。タンパク質脱免疫やワクチンの設計と開発の分野で活躍する他のプロトコルが自分の仕事を促進するのに有用であることが見つけることができます。具体的には、ステップ·バイ·ステップの手順と視覚フォーマットJoveの他のユーザーが迅速かつ簡単に、自分の研究室で、この方法論を確立できるようにする必要があります。

エンテロバクター·P99の β-ラクタマーゼ（BLA）（Genbank登録IDを表示＃X07274.1）の成熟ペプチド配列は、MHC II対立遺伝子DRB1 * 1501（ 表4）の推定上のペプチド結合物についてのProPred 16で分析した。のProPredは義務P1アンカー残基（ すなわち 、M、L、I、V、F、Y、または31を結合MHC IIのために必要とされる位置1、でW）で117ノナマーペプチドを同定した。 5％...

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A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

組換えヒトMHC II分子と生化学的アッセイは、免疫​​原性エピトープ同定、削除、または設計に迅速かつ定量的な洞察を提供することができます。ここで、384ウェルプレートにスケーリングペプチド-MHC II結合アッセイが記載されている。この費用対効果の高い形式は、タンパク質の脱免疫やワクチンの設計と開発の分野で有用であることを証明する必要があります。

ペプチドエピトープの定量分析のための高スループット、MHC II結合アッセイ

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.8K ビュー.  Dartmouth College. 組換えヒトMHC II分子と生化学的アッセイは、免疫​​原性エピトープ同定、削除、または設計に迅速かつ定量的な洞察を提供することができます。ここで、384ウェルプレートにスケーリングペプチド-MHC II結合アッセイが記載されている。この費用対効果の高い形式は、タンパク質の脱免疫やワクチンの設計と開発の分野で有用であることを証明する必要?...

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Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

抗原特異的CD4 + T細胞はMHCクラスIIテトラマーを用いての可視化

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

生物学

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

リグノセルロース系材料のためのハイスループット糖化アッセイ

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

定量的なフィットネスの分析ワークフロー

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析：タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量法

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag分析 - 高スループット、Sc2.0ジェノタイピングのためのリアルタイムPCRアッセイ

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

高スループット<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;エネルギー消費アッセイ

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...