この作品は、精神保健の健康/国立研究所（NIH / NIMH）の国立研究所によってサポートされていました＃1R21MH085267を付与します。

パート1：マルチコンパートメントのニューロンの共培養装置の製造のためのマスターの金型を準備<ol><li> PMMAマスターを製作する最初のステップは、3.5 mm深さの区画を作ることです。 One相馬コンパートメントと6軸索/グリア細胞の区画は、微粉砕機（MDX - 40、ローランドまたは他のCNC加工機）を使用して、PMMAのブロックで定義されています。 PMMAマスターは、破片を除去するために10分間イソプロピルアルコールで超音波処理しています。 </li><li> 2.5μmの高い尾根の構造体の配列は、ガラスのウェットエッチングに続いて、標準的なフォトリソグラフィープロセスにより、50.8ミリメートルX 50.8ミリメートルのガラススライドを、上にパターニングされています。 最初に、リッジ構造体の配列は、フォトリソグラフィを用いたポジ型フォトレジストS1818で洗浄したガラス基板上にパターニングされる。 S1818は、110℃に基づいて基板上にスピンコート（4000rpmの）、柔らかいです° 40用MF319でフォトレジストの開発に続いてマスクアライナを用いて5分間、そしてその後、紫外線に露出（84ミリジュール/ cm 2）のためのC秒。次に、フォトレジストパターニングされたガラス基板は、2.5μmの背の高い尾根の構造を得るために6から7分間、室温でエッチバッファ酸化物（BOE）に浸漬する。最後に、フォトレジスト層は、脱イオン（DI）水で完全に洗い流すことが続いて、アセトンとイソプロピルアルコールで除去される。 </li><li>マイクロリッジ構造を持つガラス基板は、そのパターンを転写するPMMAのマスターに対してホットエンボス加工です。 最初に、PMMA金型マスターとガラス基板を手動で整列し、ホットプレスに配置されます。その後、温度を115℃に上げいったん所望の温度に達すると、重量の0.5トンを5分間適用されます。 5分後、温度を40℃、圧力が解放されるために冷却される。 PMMAのマスターは、50.8ミリメートルX 50.8ミリメートルの大きさのブロックに切断される。 </li><li> 1重量：PDMSプレポリマー（Sylgard 184）10の比率で硬化​​剤と混合される。 </li><li> PMMAマスターは、大樽の内側に配置されており、PDMSの混合物をPDMSのマスターを作製するPMMAのマスターの上に注がれている。その後、真空ポンプに接続してデシケーターに配置されます。 PDMSは、PDMS混合プロセス中に発生する気泡を除去するために15分間脱気されたPMMAマスターの上に注いだ。 </li><li>すべての泡が削除されたときに、PDMSを重合するための1時間水平に85 ° Cのオーブン内に配置されています。 </li><li>一度PDMSが完全に硬化して、PDMSのマスターは、PMMAマスターから剥離し、トリクロロシランの2〜3滴とデシケーターの中に配置し、蒸気のコートに15分PDMSマスターの表面のためにバキュームされます。トリクロロシランコーティングは、PDMSのマスターから、最終的なPDMSニューロン共培養装置の放出を促進する。コーティング後は、PDMSのマスターは、簡単に過剰なトリクロロシランを除去するイソプロピルアルコールで洗浄し、N 2ガ ​​スで乾燥させる。 </li></ol>パート2：ニューロンの培養装置の複製<ol><li> 1重量：PDMSプレポリマー（Sylgard 184）10の比率で硬化​​剤と混合される。 </li><li> PDMSの混合物は、PDMSマスターの上に注ぎ、15分間真空ポンプに接続してデシケーター内部の脱気する。それは、マスター上の3.5 mmの高PDMS構造が完全に浸漬されていないようにあまりにも多くのPDMSを注ぐようにすることが重要です。 </li><li>すべての泡が削除されたときに、PDMSを重合するための1時間水平に85 ° Cのオーブン内に配置されています。 </li><li> PDMSは一時間後にオーブンから取り出し、冷却するために室温で放置されています。その後、PDMSニューロン培養装置を穏やかにPDMSのマスターから剥離されています。 PDMSデバイス剥がれ粉塵や破片からそれらを保護するためにパラフィルムでラップされています。 </li><li>パラフィルムでラップされたPDMSデバイスは、ブレードを装備したドリルプレスを使用して、個々の小片に切断されています。 </li></ol>パート3：デバイスの組立<ol><li> PDMSニューロンの培養装置は、プラズマクリーナーの内部に配置し、PDMSデバイスの表面が親水性にするため90秒間空気プラズマに露出される。このプラズマ処理は、ポリ- D -リジンコートした基質の組立後に培地が充填されるマイクロチャネルを容易にするでしょう。 </li><li>プラズマで処理機器は、滅菌のための30分間70％エタノールに浸漬し、滅菌バイオフードの内側に移動されます。 </li><li>滅菌装置は、70％エタノールから取り出し、ミリポアフィルタ処理されたN 2ガ ​​スで乾燥されています。乾燥装置は、6ウェル培養プレートと穏やかな圧力は、基板とデバイス間のシール性を確保するために適用されるポリ- D -リジンコートしたポリスチレンの最上位に配置されます。 </li><li>文化メディアは、6個軸索/グリア細胞コンパートメントを充填し、次いで、細胞体のコンパートメントに充填される。それは泡がマイクロチャネル内にトラップされていないことを保証するために細胞体のコンパートメントに培地を追加した後に軸索/グリア細胞コンパートメントを充填する前に1〜2分の休止を与える方が良いです。 </li><li>培地で満たされたデバイスは、すべての可能なゴミや有毒な残留物を洗うために℃インキュベーターで一晩37の内部にインキュベートする。 </li></ol>パート4：セルの負荷とニューロン-オリゴデンドロサイト共培養<ol><li>細胞培養の最初の日に、日胚からの主な前脳のニューロンの細胞は16から18匹のラットを500細胞/ mm 2の記録密度で細胞体のコンパートメントにロードされます。最初に、細胞体のコンパートメントと軸索/グリア細胞区画の両方の内側培養培地は、前のセルの負荷にピペットを用いて吸引されています。その後、培地を40μlに希釈38500細胞は、マイクロチャネル入口付近相馬のコンパートメントにロードされます。それは、デバイスと基板間のシールを破ることができるので、細胞のロード中にPDMSデバイスに触れないようにすることが重要です。 </li><li>基質への細胞接着を強化するために37℃のインキュベータ内の30分間、細胞ロードされたデバイスをインキュベートする。インキュベーション後、すべてのコンパートメントは、培養培地で埋めています。 </li><li>細胞を37で培養されています°加湿5％CO 2インキュベーター内でCと培地の半分だけが3〜4日ごとに出力が変更されています。 </li><li> in vitroでのニューロンの文化の14日後に、オリゴデンドロサイトは、共存培養のための軸索/グリア細胞区画に追加されます。生後1-2にSprague - Dawleyラットの大脳半球から切開オリゴデンドロサイトは、1000細胞/ mm 2の面積密度で各軸索/グリア細胞コンパートメントに追加されます。前にロードする細胞に、区画内の培地の約60％をピペットで吸引されています。それは、基板上に形成された軸索のネットワークに損害を与えることができるので注意が、底部基板に触れないように行う必要があります。その後、培地を5μlに希釈した6700オリゴデンドロサイト細胞は、軸索/グリア細胞区画に追加されます。細胞は、1時間インキュベートされ、コンパートメントは、培地で埋めています。 </li><li>細胞を37℃で培養されています°培地のC加湿5％CO 2インキュベーター内と半分だけが、さらに2週間ごとに3-4日を変更されます。 </li></ol>パート5：代表的な結果： 実験が正しく行われている場合、細胞体のコンパートメントにロードされたニューロンの細胞は、培養の1週間後に軸索/グリア細胞のコンパートメントの内部に形成するために開始に近いマイクロチャネル入口と軸索の層に探します。ソーマのコンパートメント内のニューロンの細胞凝集の兆候は、細胞が健全ではないことを示している可能性があります。ニューロンの文化の二週間後にオリゴデンドロサイトをロードするとき、軸索/グリア細胞コンパートメントは軸索とオリゴデンドロサイトの緻密層で覆われるべき軸索の層の上にロードする必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig1tmb.jpg" border="0" alt="図1" /> 図1ハイスループットマイクロ流体のマルチコンパートメントのCNS ​​ニューロンの共培養のプラットフォームの模式図。神経細胞体と樹状突起と同​​様に微小流体レベルの差があるコンパートメントとの間の流体分離から軸索の分離を示す断面図。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。 <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig2tmb.jpg" border="0" alt="図2" /> 図2作製とマルチコンパートメントのアセンブリ手順PDMSマイクロ流体共培養装置。各デバイスは、従来の6穴ポリスチレンの細胞培養プレートの1つのウェルに収まります。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig2.jpg">ここをクリックして</a>図2の拡大バージョンを参照すること。

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	<li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. 37, 550-575 (1998).</li><li>Taylor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2005).</li><li>Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxynitrite+generated+by+inducible+nitric+oxide+synthase+and+NADPH+oxidase+mediates+microglial+toxicity+to+oligodendrocytes.">Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

我々は、哺乳類の中枢神経軸索 - グリア相互作用を研究するためのマルチコンパートメントの共培養のプラットフォームを開発しました。中枢神経系の軸索が正常に神経細胞体/樹状突起から単離された、とオリゴデンドロサイトが正常にデバイス内部で共培養した。ニューロンの密度は、アプリケーションによって変えることができるが、低すぎたり高すぎる濃度は、細胞が死ぬことを引き...

a multi-compartment cns neuron-glia co-culture microfluidic platform

我々は、高スループットの並列で6つの独立した実験まで行うことができるin vitroでの中枢神経系における軸索-グリア相互作用の研究のための新しいマルチコンパートメントの神経細胞の共培養マイクロシステムプラットフォームを、提示する。我々は、再現性良く大量製造を可能にする、単一のソフトリソグラフィーのプロセスを介して同じデバイス内でミクロとマクロの両方のスケール構造を有するマイクロ流体デバイスを作成するための新しい製造法を開発した。 マルチコンパートメント流体共培養のプラットフォームは、オリゴデンドロサイト（OLS）のための神経細胞と6軸索/グリア細胞コンパートメント用のソーマのコンパートメントで構成されています。相馬コンパートメントと軸索/グリア細胞のコンパートメントは、軸索は軸索/グリアコンパートメントに成長できるようにしながら、物理的障壁として機能するが、相馬のコンパートメントの神経細胞体を閉じ込めることが軸索誘導マイクロの配列で接続されています。軸索/グリアコンパートメントにロードされたOLSは、ローカライズされた軸索 - グリア相互作用の研究を可能にする、軸索ではなく、神経細胞体や樹状突起とだけ対話することができます。マイクロチャネルはまた、6つの独立した実験は、より高いスループットのために単一のデバイス上で実施できるように、コンパートメント間の流体分離を有効にする。 ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）を用いたソフトリソグラフィは、生物医学マイクロデバイスで一般的に使用される技法です。これらのデバイス上の貯水池は、一般的にマニュアルパンチングにより定義されています。プロセスの簡単な、貧しい人々の配置と時間のかかる性質は、貯水池の大規模な数字が繰り返し作成する必要があるときに、このプロセスは適していないですが。新たに開発した方法は、このような限界を克服し、貯水池のマニュアルパンチングを必要としなかった。最初に、七貯水池（深さ：3.5 mm）の微粉砕機を用いて、ポリ（メチルメタクリレート）（PMMA）のブロックで行われた。その後、ガラス基板上に作製した尾根の微細構造の配列は、細胞体および軸索/グリア細胞コンパートメントを接続するマイクロチャネルを定義するためにPMMAブロックに対して、ホットエンボス加工された。このプロセスは、単一のPMMAマスター内で一致するようにマクロスケールのリザーバー（3.5 mm）およびマイクロスケールのチャネル（2.5μm）で生じた。金型マスターを務めたPDMSのレプリカは、ソフトリソグラフィーと最終的なPDMSデバイスはこのマスターからレプリケートされたを使用して得られた。 E16 - 18ラットの一次ニューロンは細胞体のコンパートメントにロードされ、二週間培養した。細胞培養の一週間後、軸索は、マイクロチャネルを交差させ、軸索/グリアれた区画内の軸索のみがネットワーク層を形成した。軸索P1 - 2匹のラットから六索/グリア細胞コンパートメントとOLS全体に均一に成長したが共存培養のためのin vitroで 14日間で軸索/グリア細胞区画に追加されました。

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A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

我々は、in vitroでのCNS軸索 - グリア相互作用の研究のための新規マルチコンパートメントの神経細胞の共培養マイクロシステムプラットフォームを開発。プラットフォームは、並行して6つの独立した実験まで行うことが可能であり、新たに開発したマクロ/マイクロハイブリッドの製造方法を用いて作製した。

マルチコンパートメントのCNSニューロングリア共培養マイクロ流体プラットフォーム

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

a-multi-compartment-cns-neuron-glia-co-culture-microfluidic-platform

Research

JoVE Journal

Biology

11.9K ビュー.  Texas A&M University (TAMU). 我々は、in vitroでのCNS軸索 - グリア相互作用の研究のための新規マルチコンパートメントの神経細胞の共培養マイクロシステムプラットフォームを開発。プラットフォームは、並行して6つの独立した実験まで行うことが可能であり、新たに開発したマクロ/マイクロハイブリッドの製造方法を用いて作製した。

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

キイロショウジョウバエの幼虫中枢神経系の解剖

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

生物学

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

細胞生物学の勾配を生むマイクロ流体デバイス

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

マイクロ流体デバイスを用いた細胞のキャプチャ

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

マイクロ流体プローブ：局在表面処理のための操作と使用方法

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

マイクロ流体フローセルを使用して流れの下で血小板粘着と凝集

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

マイクロ流体Perifusionデバイス内のマルチパラメトリック膵島Perifusionシステム

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

マイクロ流体可溶性シグナルを介した相互作用を調査するために上皮細胞や細菌の共培養

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

安定した濃度勾配で細菌走化性を定量化するためのマイクロ流体デバイス

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo and for characterizing the earliest genes involved in hematopoiesis, without having to deal with embryonic lethalities. The ES/OP9 co-culture system was originally designed to produce hematopoietic progeny, without the over production of macrophages, as the OP9 stromal cell line is derived from the calvaria of osteopetrosis mutant mice that lack functional M-CSF. The in vitro ES/OP9 co-culture system can be used in order to recapitulate early hematopoietic development. When cultured on OP9 stromal cells, ES cells differentiate into Flk-1+ hemangioblasts, hematopoietic progenitors, and finally mature, terminally differentiated lineages. The standard ES/OP9 co-culture protocol entails the placement of ES cells onto a confluent layer of OP9 cells; as well as, periodic replating steps in order to remove old, contaminating OP9 cells. Furthermore, current protocols involve evaluating only the hematopoietic cells found in suspension and are not optimized for evaluation of ES-derived progeny at each day of differentiation. However, with replating steps and the harvesting of only suspension cells one potentially misses a large portion of ES-derived progeny and developing hematopoietic cells. This issue becomes important to address when trying to characterize hematopoietic defects associated with knockout ES lines. Here we describe a modified ES/mStrawberry OP9 co-culture, which allows for the elimination of contaminating OP9 cells from downstream assays. This method allows for the complete evaluation of all ES-derived progeny at all days of co-culture, resulting in a hematopoietic differentiation pattern, which more directly corresponds to the hematopoietic differentiation pattern observed within the embryo.

mStrawberry OP9 cells allow for complete evaluation of all ES-derived progeny from co-culture.

修正されたES / OP9共培養のプロトコルは、造血後代の強化された特性を提供します。

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo ...