私たちは、設立とmStrawberry OP9細胞株のテストのためにU. Ganapatiに感謝。さらに、我々は、共培養でH. Shafifor彼女の援助に感謝。 HPは、国立心臓、肺、血液研究所（F31HL087714）（HP）からの交わりによってサポートされています。この作品の内容は、執筆者の責任であり、必ずしも国立心臓、肺、血液研究所や国立衛生研究所（NIH）の公式見解を表すものではありません。 UCLAのフローサイトメトリーコアファシリティーは、NIH（CA - 16042およびAI - 28697）、ジョンソンがんセンター、UCLAのエイズ研究所、および医学のUCLAの学校でサポートされています。

1。 ES細胞の調製<ol><li>特定の細胞株のための標準プロトコルにしたがって培養ES細胞。 0日目のためのmStrawberry OP9細胞の上にプレートするのに十分なES細胞を準備することを確認してください（ES細胞は、0日目に1cm 2当たり1 × 10 ^ 3細胞で播種されます） </li></ol> 2。 OP9細胞の調製<ol><li> mStrawberry OP9細胞を成長する前に、OP9増殖培地を準備 OP - 9細胞培養培地 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 在庫切れ </td><td> 最終濃度。 </td><td> 量（mL） </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39.5 </td></tr><tr><td> FBS（OP - 9テスト済み） </td><td> 100パーセント</td><td> 20パーセント</td><td> 10 </td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td> 100X（200mmの） </td><td> 2mMの</td><td> 0.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50mLの</td></tr></tbody></table> 準備の一週間以内に4℃と使用</li><li> mStrawberry OP9細胞を維持するために、メディアは2日ごとに変更する必要がありますし、細胞を前に（コンフルエント70から90パーセントで、サブカルチャー）コンフルエントに達した細胞の継代培養することがあります。 mStrawberry OP9細胞培養を越え​​て成長されることはありませんこのようなコンフルエント90％が脂肪細胞への分化になります。図3を参照してください。 <ol class="lalpha"><li> PBSで2倍の洗浄細胞による継代培養細胞（またはPBSで1 ×トリプシン- EDTAで+ 1 × 0.1％） </li><li> 37 予め温めておいた 0.1パーセントトリプシン- EDTAを追加℃で5分間（または細胞デタッチされるまで） </li><li>細胞がはがれるしたら、OP - 9増殖培地を加える。 50mLのコニカルチューブに細胞を移す。 </li><li>室温で5分間、300 xgで細胞をペレット化は。 上清を廃棄。 </li><li>新鮮なmStrawberry OP9増殖培地に懸濁し</li><li> 10 4細胞/ cm 2の最小密度で細胞をプレート</li><li>共培養したES細胞（0日、5日目、または実験のDay8 / 9）のために必要な日の前に3日間出発コンフルエントにmStrawberry OP9細胞を成長させる</li></ol></li></ol> 3。 ES / mStrawberry OP9共培養<ol><li>共培養の分化のメディアを準備します。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 在庫切れ </td><td> 最終的な </td><td> 量（mL） </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39.5 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 100パーセント</td><td> 20パーセント</td><td> 10 </td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td> 200mmの</td><td> 2mMの</td><td> 0.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50mLの</td></tr></tbody></table></li><li> mStrawberry OP9細胞（デイ-3） <ol class="lalpha"><li>常にその日-3でOP9細胞では、共培養の0日のためのmStrawberry OP9細胞のコンフルエントな層を持つように、サブカルチャー。図4bを参照してください。 0日目でコンフルエントのための1 × 10 4 / cm 2のプレートmStrawberry OP9細胞。 5日目と共培養の継続のため8日目/ 9サブカルチャーの余分な細胞にしてください。 </li></ol></li><li class="jove_content"> ES / mStrawberry OP9共培養のセットアップ（0日） <ol class="lalpha"><li class="jove_content"> PBSで2倍のES細胞を洗浄</li><li> 5分@ 37℃インキュベート、予め温めておいた0.25％トリプシン- EDTAでES細胞をトリプシン処理</li><li>細胞に共培養分化のメディアを追加します。 </li><li> 400xgでペレットES細胞、5 - 7分、RT。上清を捨てる</li><li>共培養分化培地中で細胞を再懸濁し</li><li> mStrawberry OP9細胞からメディアを削除する</li><li> mStrawberry OP9フラスコに共培養分化のメディアを追加します。 </li><li> mStrawberry OP9細胞のフラスコにプレート1 × 10 3 ES細胞/ cm 2である 。 37細胞をインキュベート° C、湿度5％CO 2を 。 </li></ol></li><li> mStrawberry OP9細胞（2日目） <ol class="lalpha"><li>サブカルチャーのmStrawberry OP9は、そのためには、共培養の5日目のためのmStrawberry OP9細胞のコンフルエント層を持っている。 5日目でコンフルエントのための1 × 10 4 / cm 2のプレートmStrawberryはOP9細胞（ステップ3.2として）。 8日目/ 9、必要に応じて（ステップ2.2のように）のためのサブカルチャーの余分な細胞にしてください。 </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9共培養（3日目） <ol class="lalpha"><li>慎重に共存培養から培地を除去し、新鮮な共培養分化培地に交換してください</li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9共培養（5日目） <ol class="lalpha"><li>慎重にPBSで2倍の共培養を洗う</li><li>予め温めておいた0.25％トリプシン- EDTAで細胞をトリプシン処理</li><li>共培養の分化メディアを使用してフラスコから細胞を洗浄</li><li> 400xgで細胞をペレット化、7分、RTは。 上清を廃棄 </li><li>細胞に共培養分化のメディアを追加します。細胞を再懸濁させると、単一の細胞懸濁液のために確保するために21ゲージbluntended針を使用して、 </li><li>血球計算板を用いて細胞を数える。 0日目からのES細胞の数が100から150倍に増加している必要があります。 </li><li>再シード6.48x10 4 / cm 2と -コンフルエント、mStrawberry OP9細胞の新しい層の上に7.76x10 4 / cm 2と共培養細胞</li><li> 5日目アッセイ - 残りの共培養細胞はフローサイトメトリー分析、cytopreps（30K細胞）、ChIPアッセイなどに使用することができます。 </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9共培養（日目8 / 9および12日目） <ol class="lalpha"><li>フラスコから分化のメディアを取り外し、保管します。懸濁液中の造血細胞を除去するためにPBSで洗浄単層1xは。 造血細胞を放り出すしないでください。 </li><li> 予め温めておいた 0.25％トリプシン- EDTAで接着細胞をトリプシン処理</li><li> ESの分化のメディアとのフラスコから細胞を洗浄し、サスペンション=で見つかった造血細胞に加える</li><li> 400xgで細胞をペレット化、7分、RTは。 上清を廃棄 </li><li> 細胞に共培養分化培地またはPBSを追加。細胞を再懸濁させると、血球計数器を用いて、単一の細胞懸濁液のカウントの細胞のために確保するために21ゲージbluntended針を使用してください。 </li><li>共培養は、12日目に再び8日または9で合流、mStrawberry OP9細胞の新しい層の上に再播種共培養細胞がより成熟した造血前駆細胞を評価し、14日間継続することができます。検定の日に必要な細胞の回復に基づいて再シード最適化されたセルの数。 </li></ol></li><li> ES由来の子孫（日1-14）の評価。 ES由来の子孫はmStrawberry陰性細胞（ES由来の子孫）選別の流れによって共培養のどの曜日でも評価することができます。 <ol class="lalpha"><li>フラスコから分化のメディアを取り外し、保管します。懸濁液中の造血細胞を除去するためにPBSで単層1 ×を洗ってください。造血細胞を投げてはいけません。 </li><li>予め温めておいた0.25％トリプシン- EDTAで接着細胞をトリプシン処理</li><li>共培養の分化のメディアとのフラスコから細胞を洗浄し、懸濁液に見られる造血細胞に加える</li><li> 400xgで細胞をペレット化、7分、RT。上清を捨てる</li><li> 21ゲージbluntended針とカウントで再懸濁し、細胞</li><li> ES由来の子孫は、（mStrawberry陰性細胞）mStrawberry正OP9細胞からソートされたフローすることができます。 ES由来の子孫は、その後、フローサイトメトリー解析、cytopreps、ChIPアッセイ、等によって特徴付けることができます。 </li></ol></li></ol> 4。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 ES / mStrawberry OP9共培養系。私たちの研究室では造血開発をモデル化するためにin vitroで ES細胞共培養系で使用しています。 mStrawberry OP9細胞のコンフルエントな層に配置する場合は、この共培養系では、ES細胞は、Day5でhemangioblastsに、分化する。分化した造血系統は14日目で見えるけれども共培養が進行すると、造血前駆細胞は、8日目で存在している。必要にmStrawberry OP9細胞の新たな融合性層の上に、ES由来の子孫を継代するときの矢印は、分化の日数を示している。 <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。適切なES細胞の分化 。 ES細胞は、0日mStrawberry OP9のコンフルエント層上に播種されています。 ES由来の子孫は、ES由来の子孫が定義されている境界線を持つ細胞のクラスターのように見えるか渦巻きパターンを形成し始めて、分化の3日目で見えるようになるし始める。 5日目で細胞の渦巻きを積み上げたとして内皮および造血系統のための一般的な中胚葉前駆体であるHemangioblastsは、表示されるはずです。五日以上の共培養の期間については、ES由来の子孫は、造血細胞のクラスターとして表示されます。 2〜4単細胞のクラスターは、日6月7日で、表示されるはずと共培養の8 / 9日間で大規模な細胞クラスターに成長する。他のES由来の子孫にもしっかりと接着間質細胞層にバインドされ見られる。 <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。失敗したES細胞の分化。この共培養の結果から、不適切なES細胞の分化を反映している。 ES由来の後代が5日目で渦巻き模様に表示されていないか注意してください。渦巻き模様の細胞の欠如は、不適切な血管芽細胞の形成を示している。血管芽細胞が正常に発達しない場合には、共培養の継続は、発育を妨げ造血系の細胞分化になります。不適切な血管芽細胞の形成を伴う共培養は破棄されるべきである。 <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。 mStrawberry OP9細胞培養。（）mStrawberry OP9細胞がで継代培養されていますコンフルエントに70から90パーセント。 （B）適切な分化、ES細胞やES由来の子孫はmStrawberry OP9細胞の過度に密集​​層の上に配置されます。 <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。代表的なES / mStrawberry OP9共培養フローのプロファイル。すべてのES由来の子孫はmStrawberry陰性細胞であるとmStrawberry OP9細胞からソートされたフローすることができます。 mStrawberry陰性細胞のゲートは、従来のES/OP9共培養を用いて決定した。

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	<li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+mammalian+hematopoiesis.">Embryonic origins of mammalian hematopoiesis.</a> Exp Hematol. 31, 1160-1160 (2003).</li><li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+patterning+of+the+mouse+embryo:+implications+for+hematopoietic+commitment+and+differentiation.">Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation.</a> Exp Hematol. 33, 1015-1015 (2005).</li><li>Baron, M. H., Fraser, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+early+hematopoiesis+in+the+mammal.">The specification of early hematopoiesis in the mammal.</a> Curr Opin Hematol. 12, 317-317 (2005).</li><li>Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoid+bodies:+an+in+vitro+model+of+mouse+embryogenesis.">Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis.</a> Exp Physiol. 85, 645-645 (2000).</li><li>Ganapati, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+notch+signaling+in+normal+and+neoplastic+hematopoiesis:+global+gene+expression+profiling+in+response+to+activated+notch+expression.">Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression.</a> Stem Cells. 25, 1872-1872 (2007).</li><li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (1994).</li><li>Keller, G., Kennedy, M., Papayannopoulou, T., Wiles, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+commitment+during+embryonic+stem+cell+differentiation+in+culture.">Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture.</a> Mol Cell Biol. 13, 473-473 (1993).</li><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, (1995).</li><li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphohematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+vitro.">Lymphohematopoietic development from embryonic stem cells in vitro.</a> Semin Immunol. 7, 862-862 (1995).</li><li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+hematopoietic+system+from+mouse+embryonic+stem+cells:+a+new+approach+for+embryonic+hematopoiesis.">In vitro development of hematopoietic system from mouse embryonic stem cells: a new approach for embryonic hematopoiesis.</a> Int J Hematol. 65, 1-1 (1996).</li><li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lymphohematopoietic+cells+from+embryonic+stem+cells+in+culture.">Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.</a> Science. 265, 1098-1098 (1994).</li><li>Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Embryonic stem cells : methods and protocols. , (2002).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

共培養の5日目におけるFlk1 +のhemangioblastsの生産でmStrawberry OP9細胞の結果のコンフルエント層上にES細胞の適切な分化。 Hemangioblastsは、図1に観察された細胞の渦巻きを、積み上げた表示されます。共培養の残りの部分では、目に見えるES由来の子孫は、造血細胞のクラスター（図1）として表示されます。 Day6 / 7二から四時に細胞クラスターが表示され、その共培養の8 / 9日間で大規模な細胞クラスター（接着及び懸濁液中の両方）に成長する。他のES由来の子孫にもしっかりと接着間質細胞層内にバインドされていますされています。 プロトコールに記載されていないものの、それは、FBSは、ESの増殖培地、mStrawberry OP9増殖培地およびES / mStrawberry OP9分化のメディアで使用される事前テストに不可欠です。適切にテストされた血清は、分化の5日目までは、共培養におけるES細胞の適切な分化をmStrawberry OP9細胞の適切な成長を確保するだけでなく、してください。代替として、またはmStrawberry OP9細胞に加えて、OP9細胞は、前（7.8x10 4細胞/ cm 2）コンフルエントで播種する、8000ラドで、照射することができる。 OP9細胞の照射は、繰り返し再播種ステップの排除を可能にする、だけでなく、下流のアッセイからOP9細胞を汚染、古いのほぼ完全な排除が可能になります。 OP9細胞は、CMVプロモーターの制御（pRRLsin - CMVベクター、UCLAベクトルコア）の下にレンチウイルスベクターを発現するmStrawberryの3ug/mLとOP​​9細胞を形質導入することによってmStrawberryタンパク質を発現するように設計されました。 標準ES/OP9共培養のプロトコルは、細胞の継代からOP9細胞を汚染し、古い減らすために、同様に、コンフルエント層OP9細胞上に5日目再播種のステップをES細胞の配置を伴う。さらに、懸濁液中に見られるだけ造血細胞は、ES由来の子孫を評価するために削除されます。しかし、再播種ステップとだけ浮遊細胞の収穫両方では、ある者は、潜在的に開発し、ES由来の造血細胞のかなりの数をミス。この問題は、ノックアウトESラインに関連付けられている造血欠陥を特徴付けるしようとしたときに対処することが重要になります。この問題を回避するために、私たちの研究室はmStrawberry発現OP9細胞を使用して、修正された共培養を使用。これは、すべてのESの子孫は5日目、およびダウンストリームアッセイのためのすべてのES由来の子孫の収穫のために継続的に共培養するために転送されることを保証します。この変更は、ヒトとマウスのESラインの両方に由来する造血子孫の評価および特性評価に便利なツールを提供しています。 様々な段階プリミティブと決定的な造血このES - mStrawberry OP9共培養モデルを反復する。造血開発の初期段階の研究に、多くの人々は、ES細胞から血管芽細胞の発達を評価するBL - CFC（コロニー形成細胞ブラストのような）アッセイを、使用してください。初期造血開発を調査する際BL - CFCアッセイはmStrawberry - ESの共培養システム、便利なツールですが、それは血管芽細胞の評価を可能にするため、同様に、より多くの成人の造血系統を増加ユーティリティを示す。 伝統的なOP9/ESとEBの分化プロトコルを使用して前の仕事は、HoxB4の過剰発現など、多分必要な追加の因子がin vitroでの長期的なデータの再読込み造血幹細胞を導出するためにことを示している。追加作業はmStrawberry負、ソートされたES由来の集団が、真の造血幹細胞が含まれているかどうか評価する必要がある。

OP - 9細胞の維持培地ストックコンポーネント<table border="1"><tbody><tr><td>試薬の名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td> aMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td>オメガサイエンティフィック</td><td> FB01 </td><td>事前テスト</td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td> Cellgro </td><td> 25から005 - CI </td><td> 200nmの </td></tr><tr><td>トリプシン- EDTA </td><td>セル技術を幹</td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table> ES/OP-9細胞の分化培地ストックコンポーネント<table border="1"><tbody><tr><td>試薬の名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td> aMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td>事前テスト</td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td> Cellgro </td><td> 25から005 - CI </td><td> 200mmの</td></tr><tr><td> PBS（のCa 2 +及びMg 2 +なし） </td><td> Cellgro </td><td> 21から031 - CV </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン- EDTA </td><td>セル技術を幹</td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table>

modified es / op9 co-culture protocol provides enhanced characterization of hematopoietic progeny

生体内および胚lethalitiesを扱うことなく、造血に関与する最も早い遺伝子を特徴づけるためのアクセスが困難な細胞集団を研究するときに造血細胞の運命に向かってES細胞のin vitroにおける分化と便利です。 OP9ストローマ細胞株が機能的なM - CSFを欠いている大理石骨病変異マウスの頭蓋冠から派生しているとしてES/OP9共培養系は、もともと、マクロファージの過剰産生することなく、造血子孫を生成するように設計されました。 体外 ES/OP9共培養系における初期造血発展を再現するために使用することができます。 OP9ストローマ細胞上で培養した場合、ES細胞は、FLK - 1 + hemangioblasts、造血前駆細胞、そして最終的に成熟し、最終分化の系統に分化する。標準ES/OP9共培養プロトコルは、OP9細胞のコンフルエントな層の上にES細胞の配置を伴う;だけでなく、定期的な再播種の手順を古い除去するためには、OP9細胞を汚染する。さらに、現在のプロトコルは、造血細胞懸濁液中に発見され、分化の毎日で、ES由来の子孫の評価用に最適化されていないを評価伴います。しかし、再播種ステップとだけ浮遊細胞の収穫では、ある者は、潜在的にES由来の子孫と発展途上造血細胞の大部分をミス。この問題は、ノックアウトESラインに関連付けられている造血欠陥を特徴付けるしようとしたときに対処することが重要になります。ここでは、ダウンストリームアッセイからOP9細胞を汚染の除去を可能にする改変ES / mStrawberry OP9共培養を、説明します。このメソッドは、より直接的に胚内で観察された造血分化のパターンに対応する造血分化のパターン、その結果、共培養のすべての日ですべてのES由来の子孫を完全に評価することができます。

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Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

mStrawberry OP9細胞は共培養からすべてのES由来の子孫の完全な評価が可能になります。

修正されたES / OP9共培養のプロトコルは、造血後代の強化された特性を提供します。

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.5K ビュー.  University of California, Los Angeles. mStrawberry OP9細胞は共培養からすべてのES由来の子孫の完全な評価が可能になります。

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Freezing Human ES Cells

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove residual media that could otherwise quench the Trypsin reaction.  Warmed 0.05% Trypsin-EDTA is then added to cover the cells, and the plate allowed to incubate for up to 5 mins at room temperature.  During this time cells can be observed rounding, and colonies lifting off the plate surface.  Gentle repeated pipetting will remove cells and colonies from the plate surface.  Trypsinized cells are placed in a standard conical tube containing pre-warmed hES cell media to quench remaining trypsin, and then spun.  Cells are resuspended growth media at a concentration of approximately one million cells in one mL of media, a concentration such that one frozen aliquot is sufficient to resurrect a culture on a 10cm plate.  After cells are adequately resuspended, ice cold freezing media is added at equal volume.  Cell suspensions are mixed thoroughly, aliquoted into freezing vials, and allowed to slowly freeze to -80C over 24 hours.  Frozen cells can then moved to the vapor phase of liquid nitrogen for long term storage, or remain at -80 for approximately six months.

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.

凍結ヒトES細胞

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

生物学

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  approximately one (to two) million irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells is rinsed with HuES media to remove residual serum and cell debris, and then HuES media added and left to equilibrate in the cell culture incubator.  A frozen vial of cells from long term liquid nitrogen storage or a -80C freezer is sourced and quickly submerged in a 37C water bath for quick thawing.  Cells in freezing media are then removed from the vial and placed in a large volume of HuES media.  The large volume of HuES media facilitates removal of excess serum and DMSO, which can cause HuES human embryonic stem cells to differentiate.  Cells are gently spun out of suspension, and then re-suspended in a small volume of fresh HuES media that is then used to seed the MEF plate.  It is considered important to seed the MEF plate by gently adding the HuES cells in a drop wise fashion to evenly disperse them throughout the plate.  The newly established HuES culture plate is returned to the incubator for 48 hrs before media is replaced, then is fed every 24 hours thereafter.

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.

冷凍細胞から出発培養：ヒトES細胞

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In general, the differentiation of ES cells follows the concept to first generate immature progenitor cells, which then can be propagated and differentiated into mature cellular phenotypes. This also applies for ES cell-derived neurogenesis, in which the development of neural cells follows two major steps: First, the derivation and expansion of immature neuroepithelial precursors and second, their differentiation into mature neural cells. A common method to produce neural progenitors from ES cells is based on embryoid body (EB) formation, which reveals the differentiation of cells from all germ layers including neuroectoderm. An alternative and more efficient method to induce neuroepithelial cell development uses stromal cell-derived inducing activity (SDIA), which can be achieved by co-culturing ES cells with skull bone marrow-derived stromal cells (1). Both, EB formation and SDIA, reveal the development of rosette-like structures, which are thought to resemble neural tube- and/or neural crest-like progenitors. The neural precursors can be isolated, expanded and further differentiated into specific neurons and glia cells using defined culture conditions. Here, we describe the generation and isolation of such rosettes in co-culture experiments with the stromal cell line MS5 (2-5).

Derivation of neuroepithelial precursors from embryonic stem (ES) cells using stromal cell-derived inducing activity (SDIA).

ES細胞由来の神経上皮細胞の培養

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In ...

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

ヒト胚性幹（ES）細胞の増殖

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

骨髄の造血細胞のホーミング

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

マルチコンパートメントのCNSニューロングリア共培養マイクロ流体プラットフォーム

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

マイクロ流体可溶性シグナルを介した相互作用を調査するために上皮細胞や細菌の共培養

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

三次元混合細胞スフェロイド共培養から乳腺上皮細胞の分離

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a &#8216;targeting&#8217; vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.

Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term &#8216;subcloning plus insertion&#8217;, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

サブクローニングプラス挿入（SPI） - ジーンターゲティングベクターの迅速な構築のための新しい遺伝子改変方法

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...