私達は私達とTPLSM施設を共有するために博士T.オーティス、神経生物学、UCLAの部、感謝、博士C. pEYFP - ClC1プラスミドの種類の寄付のためのFahlke、生理学研究所、アーヘン工科大学、ドイツ、、と氏技術サポートのため。R.セラーノ。この作品は、NIH / NIAMS助成AR047664とAR54816からの補助金によって支えられている。

FDBとIO筋肉の in vivoエレクトロポレーションのための実験手順<ol><li> 生体内エレクトロポレーションプロトコルで開始する前に、哺乳動物発現プラスミドはTEの添加/プラスミド2から5μgまでの範囲で濃度を得るために増幅する必要があります注：我々は日常的に商業的な増幅キットを使用すると、メーカーの手順に従う。 in vivoでトランスフェクションの骨格筋で非常によく、CMVプロモーターの仕事を運ぶ商業発現プラスミド。 </li><li>分注し、必要なプラスミド溶液の量（10〜20μl）を二0.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブ（マウスの左右の足用）に保存します。 </li><li>無菌タイロードで2 mg / mlのヒアルロニダーゼを含有する溶液を準備します。 </li><li>麻酔ボックスを使用して、深く承認されたガス麻酔器とO2のイソフルランの4％を使用して、マウスを麻酔。加熱パッド（37 ° C）に動物を配置し、齧歯類の顔のマスクを使用して麻酔を維持する。つま先のピンチの反射によって麻酔深度をモニターする。 </li><li>解剖顕微鏡で観察下、1&quot;長い33ゲージ滅菌針を用いてマウスの片足の足蹠の下ヒアルロニダーゼ溶液10μLを注入する。足のかかとに近い時点で皮膚に浸透すると〜1 / 4&quot;のための足の指の基部に向かって皮下注射針を進める。 </li><li>所望であれば他の足で手順を繰り返します。 </li><li>麻酔を外し、ケージの中にマウスを置きます。それは完全に麻酔から回復することができます。 </li><li>一時間後、二度目の動物を麻酔し、加熱パッド上に置きます。ヒアルロニダーゼ溶液について説明したのと同じ手順に続いて、プラスミドDNA（プラスミド構築体のサイズに応じて）の20〜50μgの合計を注入する。総注入量は、20未満μL/フィートにする必要があります注：15〜20μLが必要な場合に、それは組織接着剤とニードルのエントリポイントで皮膚を閉じることをお勧めします 。 </li><li>麻酔を外し、ケージの中にマウスを置きます。それは完全に麻酔から回復し、10〜15分間を待つことができます。 </li><li>三度目の動物を麻酔し、加熱パッド上に置きます。 </li><li>動物の片足を選択してください。片足は金メッキ鍼のかかとの皮膚の下に針、そしてつま先の底部の二番目。電極は足の長軸に互いに平行に配向し、垂直である。 </li><li>マイクロクリップコネクタを使用して電気刺激装置に針（電極）のヘッドを接続します。 1Hzで、20パルス、持続時間/各20ミリ秒を適用することにより、筋肉をエレクトロ。電極の間隔に応じて、パルスは電圧振幅は、〜100 V / cmの電界を生成する（オシロスコープで監視することで）調整されます注：。刺激に対する応答のない収縮は、のレベルなら認めてはならない麻酔で十分です。 </li><li>その必要に応じて、動物の反対の足で上記の手順を繰り返します。 </li><li>そのケージに動物を返し、一度、完全に麻酔から回復した観察の下でそれを維持する。注：この手順が正常に行けば、動物は30分以内に完全な移動性を取り戻し、その後ビバリウムでの動物の部屋に戻って送信する準備ができているはず。足蹠におけるヒアルロニダーゼとDNAの注射は、動物に顕著な悪影響はありません。一度麻酔から回復、マウスがケージの周りには通常アンブルすることができます。追加の予防措置として、鎮痛剤として2日間、0.0027 mg / mlの時の動物のカルプロフェンの飲料水に加える。 </li><li>タンパク質発現は2-8日間トランスフェクション後に測定することができる。しかし、多くのタンパク質の持続的な発現は、月間観察された。 </li></ol> 注：動物福祉法と実験動物の愛護ケアや使用に関するPHS方針で義務付けられてすべての動物の手順はUCLA学長の動物研究委員会によって承認された。 代表的な結果： 上記のin vivoエレクトロポレーションの手順での正しい実装はFDBとIO筋肉におけるプラスミドの効果的なトランスフェクションになるはずです。しかしながら、トランスジェニック蛋白質の変異体の発現の効率は、当社のコントロールのうちタンパク質、タンパク質の機能的特性、および他の変数の数のプラスミド、大きさと複雑さに依存します。 mCherryタンパク質のための市販のプラスミド（PMR - mCherry）符号化の存在下でエレクトロポFDB筋肉のために図1に示すように、それらのほとんどが赤色蛍光を表示するという事実によって示されているように、筋線維のほとんどは、我々のプロトコルをトランスフェクトされています。これにより、個々の繊維は、タンパク質の発現の程度が異なるを示すという可能性を除外しない、またはいくつかの繊維がすべて3でトランスフェクトされていないこと。それはBすべきeはそのようなmCherry、EGFP、ECFP、およびEYFPの蛍光タンパク質の大量の効率的な発現は、筋線維&quot;興奮性と興奮収縮連関の特性を損なわないことを指摘した。実際に、彼らは、偽トランスフェクトした筋肉（結果は示していない）のものと区別がつかない。 骨格筋線維の蛍光タグタンパク質の局所的発現を確認するために使用される実用的なアプローチ。 ディノ ​​ボ発現するトランスジェニック蛋白質の細胞内局在は、日常的に細胞構造のよく同定されたマーカーのそれぞれのタグと画像のTPLSM、蛍光画像を使用して、取得同時によって評価されます。これらの後者の最も典型的には以下のとおりです。）第二高調波発生（SHG）サルコメアのミオシン異方性バンド（M -ラインを中心に）9,10から生じる画像、および、b）のジ- 8 - ANEPPS蛍光表面とこの透過性の電位差dye11と筋線維の膜横断管状（T管）システムを標識することにより得られる画像を、。ジ- 8 - ANEPPSで染​​色した筋線維の蛍光画像では、T -細管は、ファイバーの長軸にほぼ直交する蛍光指向の狭いバンドとして表示されます。これらのバンドは、不均等に互いに離間している：彼らは、M -ラインにまたがる長距離、およびZ - 11行にまたがる短いもので区切られています。 骨格筋線維におけるα-アクチニン- EGFPの発現と局在。 構造的な筋肉の蛋白質α-アクチニンのタグ付きバリアントの発現の例を図2に示されています。このタンパク質は、そのように、日常的にこのstructure12のマーカーとして使用される、Z線の主要なコンポーネントであることが知られており、されています。我々は、EGFPをC末端にタグ付けされた人間（非筋）のためのプラスミドpEGFPN1 -α- actinin1エンコーディングα-アクチニンとFDBとIO筋肉をトランスフェクション。六日間トランスフェクション後、我々は、α-アクチニンがほとんど均等に繊維軸に沿って等間隔に狭い帯域で発現されるEGFP蛍光の分布、によって評価することを見出した。サルコメアごとに単一のバンドが（図2A＆2D）見られている。 Z -ラインと、これらのバンドの共局在は、SHG（図2B）およびジ- 8 - ANEPPS（図2E）画像でEGFP蛍光の分布を比較することによって実証される。として彼らはZ -ラインの位置と一致する、つの連続した​​M -バンドの中間に位置していることを示すオー​​バーレイ画像（図2C）、SHGのバンドと交互にα-アクチニン- EGFPのバンド、で示される。ジ- 8 - ANEPPSで染​​色したトランスフェクトされた筋線維では、α-アクチニン- EGFPのバンドは、側面にZ -ラインを（つまり、より短い距離で区切られた）が知られているT -細管（図2F）の各ペア間に集中見られているしたがって、遺伝子組換えα-アクチニンはZ線を対象としていることを示している。 EGFPとのN末端にタグDHPRα1sの発現 pEGFPC1.1 - DHPRα1Sと筋肉のトランスフェクションの効率は、それを示すTPLSMの画像（図3A）で確認されているほとんどの繊維が発現するEGFP -DHPRα1s（膜貫通型タンパク質）。トランスフェクトされた繊維の最も顕著な特徴は、このタンパク質は、T -細管をターゲットとした場合に予想されるとしてEGFP蛍光（図3A＆3B）の二重の縞模様のパターンです。それはまた別の繊維が蛍光強度の様々なレベルを表示しながら、個々の繊維の縞模様の蛍光パターンは、繊維に沿って均質に維持しているように見えることが図3で観察することができます。より高い倍率（図3B）で、それははっきりとバンドの間で不均等な間隔は、ジ- 8 - ANEPPS（例えば図2E）ステンドグラス繊維で観察されたのと似ていることが分かる。オーバーレイ画像（図3B＆3E）は、このタンパク質は、T -細管に位置していることを裏付ける、SHGのバンドがEGFP -DHPRα1sバンドの間に大きな間隔内に配置されていることを示しています。追加は、非蛍光性親油性陰イオンで測定をFRETのDPA -（データは示さず）さらにEGFPの部分はT -細管&quot;膜の内側リーフレットの数ナノメートルの範囲内であることを示している。 ローカライゼーションとEYFP - ClC1の発現の機能評価 EGFP -DHPRα1sで観察されたものと同様のパターンでEYFP -タグ付けされた骨格筋塩素チャネル（ClC1）の構造（N末端 ​​）、ディスプレイEYFP蛍光のバンド（図4A）をコードするpEYFP - ClC1、でトランスフェクション繊維&quot;表現（図3A）およびジ- 8 - ANEPPS染色（図2E）で示すように、T管の配置に対応する。として期待されるオーバーレイ（図4C）に示すように、EYFP - ClC1（図4A）とSHG画像（図4B）の重畳は、SHGのバンドが大間隔Oを中心としていることを示していますEYFP蛍光バンドの間にfを。 として機能する塩素イオンチャンネルの過剰発現から期待される筋線維の静止コンダクタンスの有意な増加でEYFP - ClC1結果、発現するかどうかを評価するために、我々トランスフェクトされたFDBの筋肉から酵素的に解離筋線維とそれらの電気生理学的特性を研究二微小電極を用いた実験では、以前に6,11,13説明した。標準的な蛍光顕微鏡の世界的な蛍光強度の測定（図示せず）から評価されるようにEYFP - ClC1を大量に発現している一つであり、他は非トランスフェクションのコントロールである：図5は、2ファイバからの結果を示しています。図5Aに電圧レコードが（EYFP - ClC1を発現している筋線維から得られる）過度の安静時のコンダクタンスが原因でそれを示し、繊維はほとんど非興奮です。最大400nA（0.5msの）の現在の刺激パルスは非常に小さいアクティブレスポンスを（オーバシュート、図5A）引き出すために使用する必要がありました。コントロールの繊維に記録されたものよりはるかに遅いと広いもののクロライドチャネルブロッカー9 - ACAの500μMを含むものへの外部タイロード溶液の交換後、200 nAの電流パルスは、活動電位を（図5B）誘発するのに十分であった（図5C）。予想通り、9 - ACAの添加は、このコントロールの繊維（図5D）に最小限の影響を持っていた。 <img src="/files/ftp_upload/1520/1520fig1tmb.jpg" alt="図1" border="0" /> 図1 生体内エレクトロポレーション法のトランスフェクション効率が。明（A）および蛍光（B）FDBの筋肉の画像は、PMR - mCherryでトランスフェクション。エレクトロポレーションプロトコルの後の日数：12日。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1520/1520fig1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大版のために。 <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure2.jpg" alt="図2" /> 図2 の発現とFDBの繊維のα-アクチニン- EGFPの標的。パネルAおよびBは、α-アクチニン- EGFPを発現する繊維で、それぞれ、EGFP蛍光とSHGイメージです。パネルCは、AとBのパネルDとEの画像の重ね合わせであり、それぞれ、ジ- 8 - ANEPPSとα-アクチニン- EGFPとステンドグラスを表現する別の繊維の蛍光イメージです。 6日間：パネルFは、エレクトロポレーションプロトコルの後にDとEの日の画像の重ね合わせです。 <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure3.jpg" alt="図3" /> 図3 の発現とFDB繊維にEGFP -DHPRα1sの標的 。パネルA、EGFP -DHPRα1sを表現する繊維のグループのEGFP蛍光画像。パネルBは、優れた蛋白質の発現の縞模様のパターンを表示するために、パネル内の正方形の拡大です。パネルCはパネルAのパネルDの画像に対応するSHGイメージなのは画像の重ね合わせであり、C.パネルEは、エレクトロポレーションプロトコルの後にパネルD.の日に示された領域の拡大である：20日。 <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure4.jpg" alt="図4" /> 図4 の発現とFDB繊維でEYFP - ClC1の標的 。パネルAおよびBは、EYFP - ClC1を表現する繊維のそれぞれEYFPの蛍光とSHG画像、、です。パネルCは、パネルでの画像の重ね合わせであるとB.パネルDは、エレクトロポレーションプロトコルの後にパネルC.の日の画像でハイライトされて白い線に沿って測定された強度のプロファイルです：7日間。 <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure5.jpg" alt="図5" /> 図5 トランス ジェニックEYFP - ClC1。パネルを表現する電気生理学的評価の繊維は、AとBはそれぞれ、9 - ACAによる治療の前と後の電流パルスに応答して、EYFP - ClC1を発現している繊維から電圧レコードです。パネルCとDは電圧レコードである（活動電位）がそれぞれ、9 - ACAによる治療の前と後の非トランスフェクション光ファイバで電流パルスに応答して誘発した。

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	<li>Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+liver+in+vivo+by+biolistic+particle+delivery.">Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery.</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+dynamic+FRET+signals+from+the+transverse+tubules+in+mammalian+skeletal+muscle+fibers.">Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.</a> J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).</li><li>DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+and+functional+characterization+of+the+transverse+tubular+system+of+mammalian+muscle+fibers+using+the+potentiometric+indicator+di-8-ANEPPS.">Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS.</a> J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).</li><li>Mills, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+actin-binding+proteins,+{{alpha}}-actinin-2+and+-3,+in+different+species:+implications+for+the+evolution+of+functional+redundancy.">Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential-evoked+sarcoplasmic+reticulum+calcium+release+is+impaired+in+mdx+mouse+muscle+fibres.">The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここでは、in vivoでのエレクトロポレーションのことで骨格筋線維へのDNAプラスミドの効果的なトランスフェクションを達成するために従わなければならない詳細な手順を説明します。我々のアプローチの主な利点は、動物にごくわずかの健康被害をもたらすの実装のシンプルさ、そしてその最小限の侵襲です。現実には、上述のエレクトロポレーションプロトコルは、麻酔下の...

dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation

細胞生物学への関心の高まりは、内因性の分布と機能的関連性を調べるために必須のタンパク質（例えば、蛍光標識の構造及び/または突然変異体）の遺伝子導入によって修飾された形態を発現させることである。完全に分化した細胞ではこの目的を達成するために実装されている面白いアプローチです<em&gt; in vivoで</em肝臓などの特定の組織への様々な方法により、プラスミドの&gt;トランスフェクション<sup&gt; 1</sup&gt;、骨格筋<sup&gt; 2,3</sup&gt;、とさえ脳<sup&gt; 4</sup&gt;。ここでは、効率の繊維に遺伝物質をトランスフェクトするために従わなければならない手順の詳細な説明を提示する<em&gt;短趾屈筋</em&gt;（FDB）と<em&gt;骨間</em使用して成体マウスの&gt;（IO）の筋肉<em&gt; in vivoで</em&gt;エレクトロポレーションアプローチ。実験パラメータは、個々の繊維で発現されるタンパク質の質と量を損なうおそれがある組織の損傷を最小限に抑えながら、トランスフェクトされた筋線維の数を最大化するように最適化されています。我々は、このホワイトペーパーで説明されている方法論の実装では、可溶性タンパク質の高収率、すなわち、EGFPおよびECFPをもたらすことが確認されました。<sup&gt; 3</sup&gt;、カルパイン、FKBP12、β2a- DHPR、等、構造タンパク質、すなわちminidystrophinとα-アクチニン、および膜タンパク質、すなわちα1s- DHPR、RyR1、心臓のNa / Ca比<sup&gt; 2 +</supFDB、IOとマウスやラットの他の筋肉に適用される&gt;交換器、NaV1.4ナトリウムチャネル、SERCA1、等、。これらのタンパク質のいくつかの効率的な発現は、生化学的に検証されています<sup&gt; 3</sup&gt;と機能的な証拠<sup&gt; 5</sup&gt;。しかし、はるかに私達が使用する最も一般的な確証的なアプローチは、蛍光標識蛋白質の構造の標準的な蛍光顕微鏡と2光子レーザー走査顕微鏡（TPLSM）、全体の式ではないだけを識別できるだけでなく、詳細な細胞内局在はです。方法は、均等に（ここに示すように）生理的関連性のタンパク質の発現をコードするプラスミドをトランスフェクトするために使用、または干渉RNA（siRNA）のため、通常は発現されるタンパク質（まだ私たちでテストされていない）の発現を抑制することを目指してすることができます。それはこれらの筋肉から酵素的に解離繊維が下の興奮性と興奮収縮カップリングの基本的なメカニズムを調べるために現在最も適切なモデルの一つであるため、FDBとIO筋線維のトランスフェクションは、哺乳類の筋肉の生理学の研究に特に関連であることに注意する必要があります電流または電圧クランプ状態<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;。

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DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

我々は、エレクトロポレーションと蛍光顕微鏡を用いたタンパク質発現のその後の可視化を使用して、生きたマウスの足の筋肉の繊維へのプラスミドDNAの効率的なトランスフェクションのための詳細な手順を説明します。

使用して哺乳類の骨格筋のDNAトランスフェクションインビボでのエレクトロポレーション

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

dna-transfection-mammalian-skeletal-muscles-using-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

17.7K ビュー.  David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles. 我々は、エレクトロポレーションと蛍光顕微鏡を用いたタンパク質発現のその後の可視化を使用して、生きたマウスの足の筋肉の繊維へのプラスミドDNAの効率的なトランスフェクションのための詳細な手順を説明します。

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Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

無傷の開発脳内の生体内の単一細胞のエレクトロポレーション

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

生物学

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

解離成体哺乳類の神経細胞へのDNAの核内マイクロインジェクション

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

アダルトゼブラフィッシュ網膜にモルフォの in vivoエレクトロポレーションに

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

隔離された骨格筋の収縮、倦怠感や交互の ex vivo での評価

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Critical to the evaluation of potential therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological assessments of muscle function. Because many pre-clinical trials rely on mouse models for these diseases, isolated muscle function has become one of the standards for Go/NoGo decisions in moving drug candidates forward into patients. We will demonstrate the preparation of the extensor digitorum longus (EDL) and diaphragm muscles for functional testing, which are the predominant muscles utilized for these studies. The EDL muscle geometry is ideal for isolated muscle preparations, with two easily accessible tendons, and a small size that can be supported by superfusion in a bath. The diaphragm exhibits profound progressive pathology in dystrophic animals, and can serve as a platform for evaluating many potential therapies countering fibrosis, and promoting myofiber stability. Protocols for routine testing, including isometric and eccentric contractions, will be shown. Isometric force provides assessment of strength, and eccentric contractions help to evaluate sarcolemma stability, which is disrupted in many types of muscular dystrophies. Comparisons of the expected results between muscles from wildtype and dystrophic muscles will also be provided. These measures can complement morphological and biochemical measurements of tissue homeostasis, as well as whole animal assessments of muscle function.

Muscle function measurements contribute to the evaluation of potential therapeutics for muscle pathology, as well as to the determination of mechanisms underlying physiology of this tissue. We will demonstrate the preparation of the extensor digitorum longus and diaphragm muscles for functional testing. Protocols for isometric and eccentric contractions will be shown, as well as differences in results between dystrophic muscles, representing a pathological state, and wildtype muscles.

筋ジストロフィーのマウスモデルから分離された骨格筋の等尺性と偏心力発生アセスメント

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

マウス精巣の生体内マイクロインジェクションやエレクトロポレーションで

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

マウス骨格筋におけるDNA損傷の検出と分析<em&gt;その場で</em&gt; TUNEL法を用いた

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNAエレクトロポレーション、筋線維の単離およびイメージング

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...