pCAG - gapEGFPプラスミド博士S. McConnellさん（スタンフォード、カリフォルニア州）から寄贈されたもの。 pCAG - tdTomatoプラスミド博士M.フェラー（バークレー、カリフォルニア州）から寄贈されたもの。我々は、技術サポートのためのパイロットスタディとCrairラボのメンバーの2つのプラスミドのCre / loxP部位戦略を検証するための単一細胞標識とアンSchohl（モントリオール、QC）の2つのプラスミドの戦略の使用を提案して博士エドワードRuthazerに感謝。 R01 MH62639（MC）、NIH R01 EY015788（MC）とNIH P30 EY000785（MC）によってサポートされています。

1。セットアップエレクトロポレーション用の機器<ol><li> 電極 ：我々は、電極として使用するデュモン＃5鉗子を変更した。 <ol><li>鉗子を分離し、分解します。 </li><li>各芯の広い端に半田線。電線接続されていると絶縁テープで先端部が露出突起の先端の約25〜30 mmを残して折り返します。 </li><li>春のアクションを提供する2つの突起の間に任意の適切なプラスチックスペーサー（ボタンなど）と一緒に修正された鉗子を元に戻します。 </li></ol></li><li> 電気機器：我々は、エレクトロポレーションし、配信されるパルスの波形と数を確認するためにオシロスコープおよびオーディオモニターのための電流パルスを供給する電気刺激装置を使用する。 <ol><li>また、刺激装置と直列に接続されているフットペダルに鉗子の一芯からワイヤを接続します。フットペダルはスイッ​​チとして機能します。それは、エレクトロポレーション用の回路を完了すると落ち込んで。 </li><li>他の突起からの電気刺激装置にワイヤを接続します。 </li><li>オシロスコープおよびオーディオモニターに刺激を接続します。 </li></ol></li><li> マイクロピペットおよびインジェクタは、セットアップ ：私たちは、直接網膜に色素またはDNA溶液の非常に少量を注入するために鋭いプルガラスピペットとNanoinject IIインジェクターシステムを使用してください。 <ol><li> 3軸マニピュレータ上にマウントインジェクターシステム。 </li><li>長いテーパーと小さな先端のガラスピペットを引き出します。 </li><li>バック鉱物油とインジェクタへのセキュリティで保護された（詳細についてはNanoinect II取扱説明書を参照）で引っ張らピペットを埋める。 </li><li>鋭いmicrodissectingはさみを使って小さな開口部（〜2-3μm）を作成し、ピペットの先端をカット。 </li><li>ピペットの先端を介して注射液を所望の量でピペットを埋める。先端の整合性が保持している限りとして、それは複数の注射や動物に使用することができます。 注：私は）十分な注射液が充填鉱物油が目に注入されることのないようなヒントにロードされていることを確認します。 ⅱ）Nanoinject IIシステムとこのビデオで使用される特定の電子機器はRGCsの成功したラベルを得るために重要ではありません。そのような他の一般的な刺激とpicospritzerやエレクトロなどの他のデバイスで作られた注射は、ラベルのRGCsにも使用できます。 </li></ol></li></ol> 2。 RGC標識用プラスミドソリューション<ol><li> RGCsの小さなクラスターを標識するため ：私たちは、CAGプロモーター（CMV即時初期エンハンサーとニワトリβ-アクチンプロモーター）の制御下に構造エンコーディングEGFPを（2〜3μg/μLの）強化された緑色蛍光タンパク質）を使用します。 EGFPは細胞膜（mut4EGFP）12にそれを標的とGAP - 43（成長関連タンパク質- 43）のパルミトイル化シーケンスでタグ付けされます。このコンストラクトはpCAG - gapEGFPと呼ばれます。 </li><li> 単一の細胞標識のために：我々は2つの構成要素の組み合わせを使用してください。最初のベクトルは、Creリコンビナーゼを駆動するCAGプロモーター（pCAG - Creを、Addgene [ケンブリッジ、MA]プラスミド13775）13であり、第二のベクターはEGFP（pCAG - LNL - gapEGFP）を標的膜に続くfloxed STOPカセットが含まれています。 pCAG - CRE（〜0.15-ng/μLが）のおかげで、少数の細胞（に強いEGFPの発現を閉じ込め、pCAG - LNL - gapEGFP（1〜2μgμL）より約1,000-10,000倍低い濃度で使用されています比較的低pCAG - Creを濃度）。 </li></ol> 3。網膜インジェクション、エレクトロポレーションプロトコル<ol><li> P5よりも古いマウスは、ケタミンのカクテルの腹腔内注射（0.7 ml / kgを）（4.28 mg / mLの）で麻酔しながらP5の仔に出生後0日目は（P0）、低体温症によって麻酔し、キシラジン（0.82 mg / ml）を、およびアセプロマジン（0.07mg/ml）14。 </li><li>ホットビーズ滅菌器内のすべての手術器具と電極チップを滅菌する。眼への熱損傷を避けるために、使用前に滅菌生理食塩水の両方で、その後涼しい。 </li><li>解剖の範囲と位置インジェクタ下の場所のマウス。 </li><li> P14（アイ開口前）よりも若いマウスの場合、外科的にミクロ解剖春のはさみb を持つ将来の眼瞼開裂の全長に沿ってカットすることでまぶたを開く。 </li><li>眼球が部分的に優しく鉗子Cの先端で目の周りに圧力を加えて突出してください。 </li><li>優しく眼球の周りの皮膚をつまんで場所に目を保持する。 </li><li>マイクロマニピュレータを調整し、眼球の近くにピペットをもたらす。 </li><li>注射液の数滴を追放し、従ってピペットの目詰まりがないことを確認するために、Nanoinject IIシステムに接続されているフットペダルを、押します。 </li><li>眼球を安定させる一方で、ガラスピペットの先端が網膜色素上皮を介して貫通し、網膜に入るようマニピュレータを移動する。 </li><li> DESを注入するNanoinject IIシステム用のフットペダルを押すことにより、溶液の量を赤外LED。例えば、単一のRGCsにラベルを付ける私達は2.3 4.6nLの単回注射を行う。 </li><li>ピペットを収納し、慎重に注射部位を介して直接電極チップを配置し、回路を完成し、目をエレクトロに刺激するためのフットペダルを押し下げる。我々は一般的に25V強、50ミリ秒持続時間、間隔1秒の設定で矩形パルスを使用してください。 10パルス（各極性の5パルス）P4と6パルスより古いマウス（各極性の3パルス）に適用されていますがP0にP3マウスに適用されます。 </li><li>慎重にソケットに戻す眼球を押して、カットのまぶたを介して滅菌眼軟膏を適用する。 </li><li>温度制御された熱パッドで、十分な復温と機動性を含めて完全な復旧、の上に置いて動物は、母親に動物を返します。 </li><li>動物のような運動機能の喪失、新郎の姿勢異常や障害など、痛み、苦痛や不快感、任意の符号のための12時間ごとに監視します。麻酔、注射とエレクトロポレーションの繰り返しのラウンドは、同じ動物で実行されるべきではない。 </li></ol> 4。ノート<ol><li>このビデオで説明されている注射の方法は、&quot;ブラインド&quot;の注射です。アルビノマウスと着色されたソリューション（高速青の微量とDIIまたはプラスミド溶液）で作業する際に、これは注射の量や場所を可視化することが可能です。しかし、色素性マウスと系統の注入場所は、直接可視化することはできず、それゆえに口頭で、意図された網膜の場所やどのように遠くまでは特にRGC層をターゲットにピペットを移動する必要があるに達しているかどうかを記述することは困難です。したがって、我々は強くこれらの注射は、網膜ですぐに視覚化できるため、最初のアルビノマウスのDIIの注射で開始する新規ユーザーに助言し、RGC網膜に投影し、脳のラベリングは、注入の品質を評価するために使用することができます。フォーカル注射のためのN、N -ジメチルホルムアミド（100％）で10％のDIIを準備します。この手順を習得されるとユーザーは、一貫して着色したマウスでは明らかなDNAプラスミドソリューションでRGCsをターゲットにすることができるはずです。 </li><li>このビデオで説明されている注射の方法は、retinotopy勉強する細胞のラベル小さな集団（4.6nLラベル数百RGCS）14とに結合した蛍光色素（Alexa555、488など）とバルクラベルのRGCsに焦点DIIの注射をするために使用することができますコレラ毒素サブユニットBは、上記の＃10のエレクトロポレーションのステップを除く、眼特異分離を検討する。すべてのソリューションのP14より若いマウスのためのP14と1 - 2uLより古いマウスの2 - 3uLの最大総注入量が推奨されます。 </li><li>ピペットは、インジェクタにピペットを装着する前にミネラルオイルで埋め戻し、チップを破壊することによって続いて注入するソリューションを充填することができます。ピペットの先端からロードすることは非常に粘性と困難な一般的な高濃度のDNA溶液を（〜6ug/uL）、使用するときに特に便利です。 </li><li>ガラスピペットの目詰まりになった場合、慎重に染料（DII）ソリューションのためのDNA溶液とエタノール（100％）のために水に浸した綿棒でピペットの先端を拭きます。 </li><li>目に注入した後、眼球からピペットチップを収納して、再度注入するフットペダルを押してください。これは、先端が注入プロセスの間に詰まるされていないことを確認することです。解が分注されていない場合、それは注入が成功しない可能性が非常に高いです。しかし、これは注射が失敗したことを絶対的な記号として解釈されるべきではない。複数の注射部位や細胞の大規模な数のラベルが望まれる場合実験者は再び同じ目を注入することができる。 </li><li>シングルRGCsを標識するため、Nanoinjectのコントロールボックスで減速する射出速度を設定します。これにより、さらにシステムが同時にガラスピペットの先端が眼球からすぐに撤回されている間に解決策を分配するために、この設定でより多くの時間がかかるように網膜に注入された溶液の量を減らします。 </li><li>それは（これは目が通常よりも明らかに小さい場合に、回復の数日後に明らかになる）目を損傷することは非常に容易であるため、生後0〜3（P3 P0に）マウスのエレクトロポレーションは、さらに注意が必要です。印加されるパルスおよび電圧の数を減らすと、早期新生児マウスのお勧めです。 P4の後に、眼球はエレクトロポレーションによる損傷に対してより弾力性があります。 </li><li> EGFPまたはRFPの経験膜をターゲットバージョンでは（&#39;gapEGFP&#39;は、12を参照）、脳にretinofugal予測を調べるための未修正のGFPよりはるかに優れています。しかし、変更をターゲットと膜を欠いているpCAG - tdTomatoは、、また、うまく機能（図1E）。さらに、デキストランコンジュゲートの蛍光色素は、上述のエレクトロポレーションプロトコルを使用してラベルのRGCsするために使用することができます。 </li><li>一般に、10注射のうち9はデュアルプラスミドアプローチで、ラベル付けRGCsに注射のものみの約15％を鉛化されなくなります。レッテルを貼られるだけで、単一のRGCになります。成功事例の数は、1つ目の複数の場所にDNAを注入することにより、またはそれぞれの目に異なる蛍光タンパク質をコードするプラスミドを注入することにより増加することができます。 </li></ol> 5。代表的な結果 RGC標識は、エレクトロポレーションとトランスフェクション後少なくとも3週間の維持発現後24時間でRGCsにおけるEGFPのラベルで、P2からP25まで、あらゆる年齢層で観察された。 蛍光標識された樹状突起（図1A、B）と、単一のRGCsの軸索の喬木（図1F）が明確に可視化し、再構成することができる。 離れてRGCsから、この手法は、水平細胞、双極細胞と様々なアマクリン細胞のサブタイプ（図1C）などの他の網膜細胞の種類にラベルを付けるために使用することができます SCの通常のretinotopy（図1E）が示すように、この方法では、視覚的なマップの洗練の通常の時間経過を妨げることはありません。 すべての年齢層では、ケースの約90％、pCAG - gapEGFPの小容量注入（〜2.3 - 4.6nLは）いくつかのRGCs（図1D）での発現につながった。 RGCs（図1A、B、D）やアマクリンのような他の細胞型を含む単一の網膜神経細胞のラベリングにつながったpCAG - CREおよび動物ごとpCAG - LNL - gapEGFP組み合わせのプラスミドの単回注射を使用して、試験の約15％で細胞（図1C）。 <img src="/files/ftp_upload/2678/2678fig1.jpg" alt="図1" /> 図1 - 。P8でシングルスターバーストアマクリン細胞の、B.出生後14日目のフラットマウントの網膜では、単一の網膜神経節細胞（矢印の頭が軸索を指す）というラベルのEGFPの例（P14）】実施例D。 。P14でフラットマウント網膜にRGCsとアマクリン細胞を含む網膜神経細胞を標識したEGFPのクラスタ。右目のE.背と腹側RGCsがエレクトロと左眼でEGFPと時間と腹RGCsで標識されたが電気めっきされたとP1でtdTomatoで標識。ラベル付けRGCsによって形成されるターゲットゾーン（アスタリスク）はP9のSCで、その地形的に正しい場所（ホールマウント、白の輪郭）で見ることができるのRGCアーバ（2次元投影）とラベルの付いた単一のEGFPの。F.例 SCの矢状断面（250μm厚）（点線）。明確にするために、画像の（D）及び（F）グレースケールに変換し、反転されています。スケールバー（ミクロン）：（） - （D）、（F）：100;（E）：500

<ol>
	<li>Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+development+of+visual+maps+and+receptive+fields.">Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields.</a> Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).</li><li>McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. 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利害の衝突は宣言されません。

このビデオでは、in vivoでのエレクトロポレーションプロトコルで示している蛍光タンパク質をコードするDNA構築物と出生後のマウスの網膜神経細胞の単一または小さなクラスターのラベリング結果。以前の研究では、そのエレクトロポレーションは、通常のRGC軸索アーバ洗練と干渉していないことを示す、親油性染料とRGCラベルを使用しているものとしてdLGNとSCに蛍光標識した...

<table border="1"><tbody><tr><th>材料</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>デュモン＃5鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11252〜20 </td></tr><tr><td>電気刺激装置</td><td>グラスの楽器</td><td>モデルS4 </td></tr><tr><td>オシロスコープ</td><td>アジレント</td><td>モデル54621A </td></tr><tr><td>オーディオモニター</td><td>グラスの楽器</td><td>モデルAM8B </td></tr><tr><td>プラー</td><td>サターインスツルメンツ</td><td>モデルP - 97 </td></tr><tr><td> Vannasはさみ</td><td>世界の精密機器</td><td> 14003 </td></tr><tr><td>マイクロはさみB </td><td>テッドペラ</td><td> 1347 </td></tr><tr><td>デュモンAA鉗子C </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11210〜20 </td></tr><tr><td> IIシステムをNanoinject </td><td>ドラモンドサイエンティフィック</td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td>ガラスピペット</td><td>ドラモンドサイエンティフィック</td><td> 3から000 - 203 - G / X </td></tr><tr><td>フットペダル</td><td>ドラモンドサイエンティフィック</td><td> 3-000-026 </td></tr><tr><td>鉱油</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M3516 </td></tr><tr><td> DII </td><td>インビトロジェン</td><td> D - 383 </td></tr><tr><td> N、N -ジメチルホルムアミド</td><td>シグマ</td><td> D4551 </td></tr></tbody></table>

transfection of mouse retinal ganglion cells by in vivo electroporation

中脳へのRGC予測の対象指定と洗練は、開発時に神経接続の形態の方法正確なパターンを研究するための一般的かつ強力なモデルシステムです。マウスでは、retinofugal予測は、地形的および視床と上丘（SC）の外側膝状核（dLGN）でフォームの眼特異層に配置されています。 retinofugal突 ​​起のこれらの正確なパターンの開発は、典型的には、西洋ワサビペルオキシダーゼ1〜4と蛍光色素およびトレーサーとRGCsの集団を、標識することにより研究されている。しかし、これらの方法は、網膜部位の地図形成の根拠となる個々のRGC軸索のあずまや形態の発達的変化への洞察を提供するために、あまりにも粗いです。彼らはまた、RGCsの遺伝子操作のために許可されていません。 最近、エレクトロポレーションは、網膜5月11日に荷電分子を送達するための正確な空間的、時間的な制御を提供するための効果的な方法となっています。現在の網膜エレクトロポレーションプロトコルは、遺伝子操作が可能で、出生後のマウスのRGCsの単一または少数のクラスタのretinofugal予測のトレースをしないでください。それは 、in vivo エレクトロポレーションで生後は標識効率が極めて低いためRGCsをトランスフェクションするための実行可能な方法ではない、したがって、RGC前駆細胞の分化と増殖6を受けている胚の年齢でターゲティングが必要と主張されています。 このビデオでは、標的遺伝子の配信、shRNAを、そして出産後マウスRGCsに蛍光デキストランのためのin vivoエレクトロポレーションプロトコルで説明します。この手法は、分岐、ラミネーション、再生および回路の開発の様々な段階におけるシナプス形成、軸索の退縮を含む神経発達のいくつかの側面に関与候補遺伝子の効率的なスクリーニングのための迅速で効果的なコストかつ比較的容易にプラットフォームを提供します。要約すると我々はここで知覚マップの開発の根底にある分子メカニズムのさらなる洞察を提供する貴重なツールについて説明します。

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

我々は、実証<em&gt; in vivoで</em網膜神経節細胞（RGCs）と幅広い年齢層にわたって出生後のマウスでは他の網膜の細胞型の単一または小さなクラスターをトランスフェクトするための&gt;エレクトロポレーションプロトコル。ラベルを付けたり、遺伝的に生後RGCsを操作する機能<em&gt; in vivoで</em&gt;発達研究のための強力なツールです。

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

transfection-mouse-retinal-ganglion-cells-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

15.4K ビュー.  Yale University. 我々は、実証 in vivoでエレクトロポレーションプロトコル。ラベルを付けたり、遺伝的に生後RGCsを操作する機能 in vivoで発達研究のための強力なツールです。

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An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

遺伝的に標識された網膜神経節細胞からの光は応答を記録するために隔離された網膜の準備

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

神経科学

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

開発マウス網膜の in vivoエレクトロポレーションで

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

開発マウス内耳への遺伝子導入による<emインビボで&gt;</em&gt;エレクトロポレーション

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

局所トランスジェニックラットの発生により<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションおよび<em&gt;インビボ</em&gt;生物発光スクリーニング

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

マウスの網膜神経節細胞におけるシナプスと人工コンダクタンスによるダイナミッククランプの実装

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

蛍光色素で大人のゼブラフィッシュの網膜神経節細胞の逆行性標識

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

エレクトロポレーションによる齧歯類坐骨神経内のシュワン細胞へのインビボ遺伝子導入で

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

網膜神経節細胞の定義されたサブセットの単一細胞RNA-Seq

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

光干渉断層計: マウス網膜神経節細胞In Vivoイメージング

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

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