著者は、彼らのコラボレーションと後方支援のために分析化学、ローマ大学&quot;トルヴェルガータ&quot;の研究室からナンシーダウナーとすべてのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、EUのプロジェクト&quot;BioCop&quot;によってサポートされていました。

1）被覆磁気ビーズをブロッキング： 被覆磁気ビーズをブロックするために以下のように進んでください： <ol><li> 2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブのセットを準備します。 </li><li> （揺れがボルテックスではない）ミキサーを回転させるサンプルを用いてコーティングされた磁気ビーズを（被覆磁性ビーズの調製のための付録を参照）ホモジナイズ。 </li><li>すぐにホモジナイズ後、ピペットそれぞれ別々のエッペンドルフチュー​​ブに被覆磁性ビーズ10μlの; </li><li>セットの各エッペンドルフチュー​​ブに脱脂乳ブロッキング溶液の1mlを追加します。 </li><li>回転サンプルミキサーに室温で30分間インキュベートした磁気ビーズを許可しなさい; </li><li>ソリューションブロッキング削除：2分（チューブの側壁に付着した磁性ビーズを参照）のために置くの磁気部分に磁性粒子のコンセントレータにチューブを置くそのようにして、慎重にビーズが邪魔されずに残し、上清をピペットで。 </li><li> PBS緩衝液1ml + NaN 3を + BSA、各チューブのためのストレージソリューションとして追加します。 </li><li> 4で被覆した、ブロックされた磁気ビーズを保存° C（被覆磁性ビーズは4℃で少なくとも2ヶ月間安定であることに注意してください）​​。 </li></ol> 2）検量線の建設及び試料分析のための磁気ビーズで免疫チェーンは、 測定の準備ができて磁気ビーズを持っている以下のように進んでください： <ol><li>を分析しようとしている各サンプルの抽​​出のためのコーティングとブロックされたソリューションの1つのエッペンドルフチュー​​ブ（2 ml）を取る。 </li><li>各ワーキング較正ソリューションのための余分なエッペンドルフチュー​​ブを取る; </li><li>使用前に回転するサンプルミキサーで2分間磁性ビーズをホモジナイズ。 </li><li>磁性粒子の集配信装置を使用してストレージの液体を取り除く。 </li><li> PBS / BSA洗浄液で磁気ビーズを3回洗浄する。液体洗濯取り外します。 </li><li> 競争のステップ ：調製した抽出試料の200μlの洗浄、磁気ビーズを含む各チューブのために追加、各サンプルごとに1つの磁気ビーズチューブを使用。各標準溶液についても同じ手順を繰り返します。それぞれの磁気ビーズチューブにモノクローナル抗体溶液200μlを追加。磁気ビーズは、室温で回転するサンプルミキサーで半時間インキュベートを許可しなさい; </li><li>エッペンドルフチュー​​ブから競争段階に使用する溶液を除去し; </li><li> ラベリングのステップ：各磁気ビーズをエッペンドルフチューブに標識二次抗体の400μlを追加する。磁気ビーズは、室温で回転するサンプルミキサーで半時間インキュベートを許可しなさい; </li><li>エッペンドルフチュー​​ブから標識溶液を取り除く。 </li><li>磁気ビーズをPBS / Tweenで三回® 20洗浄液を洗浄してください。液体を取り除く。 </li><li> DEA緩衝液100μlと磁性ビーズの各アリコートを再懸濁します。今すぐ磁気ビーズは、電気化学測定のステップの準備ができています。 </li></ol>マルチプレクサ（MUX）のオプションとPalmSens 3）組立ご注意：基質加水分解の酵素製品は、電極表面を汚す、この理由のために新しい電極は、測定ごとに必要とされる。 <ol><li>シリアルケーブルを介してPalmSensにPCのラップトップを接続してください。 </li><li> PalmSensとCH8マルチプレクサの9 - DINプラグを接続します。 </li><li> CH8マルチプレクサ付き8チャネルマルチプレクサ電気接点のシリアルケーブルを接続します。 </li><li> eight磁石ブロックの電極ストリップを配置。各作用電極の下にそれぞれの磁石を配置するために注意を払う（音符の、各電極のための単一の磁石の必要性は特に磁性粒子が作用電極の面積に集中されませんが必須です）。 </li><li> 8チャンネルマルチプレクサ電気接点に電極ストリップのプラグイン; </li></ol> DPV測定のために適切なボックスに次のパラメータを使用します。 E：0から始まります（V）、Eの端：0.6（V）、Eステップ：0.016（V）、Eパルス：0.0339（V）、Eコンディショニング：0（V）、Eの堆積：0（V）、スキャン速度を：0.1（V /秒）、Tパルス：0.06（秒）、Tエアコン：0（S）、T堆積：0（S）、Tの平衡：8（S）。 4）酵素反応と電気化学測定<ol><li>静かに磁気ビーズの十分に分散懸濁液を得るために、電気化学測定のステップの準備ができて磁気ビーズを含む各エッペンドルフチュー​​ブを振とうすることによりホモジナイズ; </li><li>すぐに均質化後の各エッペンドルフからピペット、、対応する作用電極の表面に磁気ビーズ分散の20μlのアリコート。つのストリップの使用の各電極​​に異なるエッペンドルフチュー​​ブ（8電極を使用する8種類のエッペンドルフ用など）から採取した磁性ビーズを20μlのための; </li><li>第一の電極上に酵素基質溶液80μlを加え。 2分がカウントダウン開始。 14秒後に、第二の電極上に酵素基質溶液80μlを加える。さらに14秒後に、第三の電極に酵素基質溶液80μlを加える。同じ時間int型で進む最後の電極（14秒の間隔で基板の各アリコートを落とすことを意味する）までerval（14秒）。 14秒のインターバル時間は、測定を実行するためにポテンシオスタットが必要とする時間として計算されます。音符で、各センサーで80μlのソリューションは、作業、参照と対極をカバーする必要があります。また、各センサーのためのソリューションは、隣接する電極のソリューションと接触してはいけません。 </li><li> 2分は、酵素基質溶液の最初の添加からカウントダウンした後、電気化学測定を開始します。 </li><li>ソリューションごとに電流のピーク値（μA）を取得するためにPalmSens Liteソフトウェアを使用してください。 </li></ol> 5）計算ロジスティック4パラメータの式を用いて検量線を確立し、未知のサンプルを含む各エッペンドルフチュー​​ブ用ミリリットルあたりナノグラムのトータルHT-2/T-2毒素の量の濃度を計算する。 シグマプロット8.0を使用して実験データ、calibrants（ng / ml）の濃度に対するピーク高さ（μA）、非線形的に4パラメータロジスティック（4 - PL）式のプロット（1）（使用して装着しなければならないかカレイダグラフ）。非線形4 - PLのモデルは、通常、リガンド結合アッセイ（LBAの）6を記述するために採用されています。 <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq1.jpg" alt="式（1）" /> （1） シグマプロットのカーブフィッティングプログラムによって与えられるように、B、X0、Y0はロジスティックパラメータです。 希釈されたサンプルの抽​​出液でHT-2/T-2毒素総量の含有量を計算するexplicated式を使用して、 <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq2.jpg" alt="式（2）" /> （2） xはmilliltreあたりナノグラム（ng / ml）の中の物流の4つのパラメータの式から計算希釈抽出液中のHT-2/T-2毒素の合計量の質量濃度、です。 yは、未知試料に対して得られたμAの電流値です付録 6）被覆磁気ビーズ被覆磁気ビーズを持っている以下のように進んでください： 洗浄法 <ol><li>磁性ビーズの濃度は常に再現性を保証するために、同じである必要がある注意してくださいtosylactivated Dynabeads ®は、1分間（最大速度）しながら、ボルテックスでM - 280を（ストック溶液2 × 109ビーズ/ ml）を（発泡避ける）（ホモジナイズ測定）; </li><li>すぐに2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに上記の均質化ビーズを1mlのピペット。 </li><li> 2分（チューブの側壁に付着した磁性ビーズを参照）のために置くの磁気部分に磁性粒子のコンセントレータにチューブを置きます。 </li><li>慎重にビーズが邪魔されずに残し、上清をピペットで。 </li><li>磁性粒子のコンセントレータからエッペンドルフチュー​​ブを外し、0.1 Mホウ酸バッファーpH9.5 1mlにビーズを懸濁します。 2分間回転サンプルミキサーで2分間穏やかに混ぜる。 </li><li>上清をピペットで。 </li><li>エッペンドルフチュー​​ブにホウ酸緩衝液のピペット1ミリリットル。磁気ビーズは、今のコーティング工程のための準備ができています。 </li></ol> コーティングの手順 <ol start="8"><li>インキュベート磁気ビーズとHT - 2 - KLHのためのソリューション、KLH（キーホールリンペットヘモシアニン）磁気ビーズを1mlのストック溶液）（375 mg / mlの最終的なHT - 2 - KLH濃度）とHT - 2共役600 mlを加え20H 37℃*サンプルミキサーを回転させる上でゆっくりとチルトの回転と、 </li><li>インキュベーションの場清オフ磁性粒子濃縮器とピペットでチューブの後に; PBS / BSA緩衝液1mlでコーティングされたビーズを2回洗浄する。それぞれの洗浄の間にPBS / BSA溶液を取り除く。すべての洗浄工程を5分間ミキサーを回転させることで磁気ビーズを設定し、PBS / BSA行った。 </li><li> TRIS / BSA緩衝液1mlを用いて一度磁気ビーズを洗浄してください。 TRIS / BSA溶液を取り外します。 37℃で4時間のためにミキサーを回転させることで磁気ビーズとTRIS / BSAバッファーを設定することにより、このステップを行う° C *; </li><li>リフレッシュの1mlを用いて一度磁気ビーズを洗浄してください（4で冷蔵庫で保管° C）PBS / BSA緩衝液。 PBS / BSA溶液を除去。室温で5分間ミキサーを回転させることで磁気ビーズとPBS / BSAバッファーを設定するこの手順を行う。 </li><li>ステップは、すべての洗浄液を削除し、追加の洗浄後、1mlのPBS緩衝液+ NaN 3を + BSAストレージ液として; </li><li> 4 ° C（被覆磁気ビーズは、4で少なくとも2ヶ月間℃で安定していることに注意してください）​​でコーティングされた磁気ビーズを格納します。 </li></ol> *この目的のために、ミキサーは電源供給用ケーブルを挿入できる穴を装備したオーブンに入れられます。またミキサー℃を37℃恒温室内に配置することができます 7）サンプル調製と抽出細かく粉砕されたサンプルの25gは、（ベビーフードや朝食シリアル）我々です。ブレンダージャーにighedと高速ブレンダーで3分間、アセトニトリル/水の溶液（14分の86）の100mlで抽出した。 5分を4000 rpm（3000 G）、上清を8 mlの遠心分離がMycosepカラムで撮影し、精製した後、洗浄したエキスを4 mlを窒素気流下で乾燥させた。乾燥試料は、数ヶ月に-30℃まで保存することができます。 8）サンプルの再構成 朝食シリアル 再構成するPBS pH7.4の40mlで乾燥朝食用シリアルのエキス（穀物ベースの食品は、成人の消費に向かう）。このように仮定法的限界（200 ng / gであった）に等しい毒素の濃度のサンプルでは、​​測定ステップでの作業範囲の中央に立ち下がり信号を与える。 ベビーフード PBS 4 mlで再構成する乾燥ベビーフード抽出物（穀物ベースの食品は、乳児の消費に向かう）。このようになっ法定上限（20〜25 ng / gであった）に等しい毒素の濃度のサンプルでは、​​測定ステップでの作業範囲の中央に立ち下がり信号を与える。

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	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

生体分子認識プローブとしての抗体の使用は、センシング技術の普及を見ている、そのようなELISAおよびMEIAsなどの免疫化学的検出手法は、多くの研究室7で最も使用されると適用されるプラットフォームの間で、今日では、です。 これらのアプローチは、優れた感度と特異性を達成しながら、過去数年間で多くの研究グループの主な目的は、彼らのパフォーマン?...

試薬<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td>カリウム塩化</td><td>シグマ</td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td>カリウムリン酸二水素</td><td>シグマ</td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸水素二ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム塩化</td><td>シグマ</td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2の無水</td><td>シグマ</td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA（99.5％） </td><td>シグマ</td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td>塩酸37パーセント</td><td>シグマ</td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td>シグマ</td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td>トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン</td><td>シグマ</td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA（ウシ血清アルブミン） </td><td>シグマ</td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOHで</td><td>シグマ</td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td>シグマ</td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3を </td><td>アルドリッチ</td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1 - ナフチルりん酸二ナトリウム塩</td><td>フルカ</td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td>スキムミルクをブロッキング溶液 - 非脂肪ドライミルク</td><td> Bio - Rad社</td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> ：KLH（キーホールリンペットヘモシアニン）、ストック溶液（PBS中の1 mg / ml）を持つHT - 2共役</td><td>ピュア</td><td> 004050 </td><td> HT - 2 - KLH複合体は、HT - 2トキシンでの位置3と4の遊離OH基がN、N&#39; -カルボニルジイミダゾール（CDI）と活性化HT - 2毒素WASによってアクティブ化されたCDI法によって得られた安定したcarbammateリンケージを生成するタンパク質（KLH）のアミノ基と反応することができます。 </td></tr><tr><td>二次標識抗体：馬から抗マウスIgG（H + L）、アルカリ性ホスファターゼと結合した、濃度1 mg / mlの。 </td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> AP - 2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT - 2トキシン</td><td>ピュア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁気ビーズ：Dynabeads ®は</td><td> DYNAL </td><td> M - 280 Tosylactivated </td><td>濃度2 × 10 9ビーズ/ mlの。 </td></tr></table>ソリューション<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 準備 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH7.4の緩衝化</td><td>水900 mlに塩化カリウム0.20gの、リン酸二水素カリウム0.20gの、リン酸水素二ナトリウムの1.16 gおよび塩化ナトリウムの8.00グラムを溶かす</td><td></td></tr><tr><td>ジエタノールアミンバッファー、DEA、0.97 M + 1mMのMgCl 2 + 0.15 MのKCl、pHは9.8 </td><td>水の〜300mlの塩化マグネシウム無水およびKClの7.3.59 gの0.0476グラム溶かす。解散後はDEAの51ミリリットル（99.5％）を追加します。塩酸（6M）で9.8にpHを調整する。水で500 mlに希釈する。 </td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸緩衝液、0.1 M、pH9.5の</td><td>蒸留水の約300 mlのH 3 BO 3の3.09グラムを溶かし、NaOHおよび/ ​​または塩酸（6 Mまたはより低い濃度）で9.5にpHを調整する。蒸留水で500 mlに希釈する。 </td><td></td></tr><tr><td>トリス緩衝液、0.2 M、pH 8.5の</td><td>水100ml中のトリス[ヒドロキシメチル]アミノメタンの3.85グラムを溶かす。 NaOHおよび/または塩酸（6 Mまたはより低い濃度）でpH8.5に調整してください。水で200mlに希釈する。 </td><td></td></tr><tr><td> TRIS緩衝+ BSA溶液（0.1％）、pHは8.4 </td><td>トリス緩衝液pH 8.4の50ml中にBSAの0.050グラムを溶かす。 </td><td>このソリューションは、新鮮な使用の当日に準備する必要があります。 </td></tr><tr><td> PBSバッファー+ TWEEN ® 0.05パーセント</td><td>事前に準備したPBS緩衝液（pH7.4）500mlにTween 20の0.250グラムを溶かす</td><td></td></tr><tr><td> PBSバッファー+ BSA液0.1％ </td><td> PBS緩衝液、pH7.3に50mlのBSAの0.050グラムを溶かす。 </td><td>このソリューションは、新鮮な使用の当日に準備する必要があります。 </td></tr><tr><td> PBS緩衝液+ 0.1％BSA + NaN 3を 0.02パーセント</td><td> PBS緩衝液、pH7.3に50ml中のNaN 3のBSAおよび0.010 0.050グラムを溶かす。 </td><td>ストレージゾルution </td></tr><tr><td>酵素基質</td><td> DEA緩衝液pH 9.8 100 mlの1 - ナフチルりん酸ナトリウム塩0.010 gを溶かす。アルミホイルでしっかりとフラスコを巻きます。 </td><td>このソリューションは、新鮮な使用の当日に準備する必要があります。 </td></tr><tr><td>スキムミルクブロッキング溶液</td><td> PBS緩衝液、pH7.3の200mlにグレードブロ​​ッカー脱脂粉乳（Bio - Rad社、ヘラクレス、CA、米国）をブロッティング0.20gのを追加。 </td><td>このソリューションは、新鮮な使用の当日に準備する必要があります。 </td></tr><tr><td> HT - 2ストック溶液</td><td>をアセトニトリル10mlに、トリコテセンHT - 2毒素のバイアル10 mgを溶かし 1 mg / mlの濃度の溶液。 </td><td> 30mlの単回使用アリコートにこのソリューションを分割し、-30℃未満で保管します</td></tr><tr><td> HT - 2は、標準溶液の作業</td><td>ピペット2ミリリットル校正されたメスフラスコにHT - 2トキシンのストック溶液20ml及びトリコテセン毒素の10μg/ mlを含むHT - 2ワーキング溶液を調製するためにアセトニトリルで希釈する。 </td><td>このソリューションは、新鮮な使用の当日に準備する必要があります。 </td></tr><tr><td>較正ソリューションワーキングHT - 2 </td><td>ワーキング較正液100 ng / mlに調製するためにHT - 2作業標準溶液（10μg/ ml）を希釈する。下記の濃度0（ブランク）、0.5、1、2、4、10 ng / mlの較正ソリューションを作業準備するHT - 2営業較正液100 ng / mlに希釈する。 </td><td>これらのソリューションは、使用当日に新しく調製する必要があります。 </td></tr><tr><td> KLHとHT - 2共役</td><td> 350μlのの単回使用アリコートにKLH（キーホールリンペットヘモシアニン）ストック溶液（PBSで1 mg / ml）でHT - 2共役分割。 </td><td> -30℃で保存のアリコート</td></tr><tr><td>特異的モノクローナル抗体</td><td>競争のステップで使用するPBS中のモノクローナル抗体のストック濃度（1.383 mg / ml）を：1:350（V V）を希釈する</td><td>この溶液は使用時の瞬間に新しく調製する必要があります。 3.5ミリリットルの最終体積のPBSで10 mlの抗体ストック溶液は、17の規格及び/またはサンプルを分析するのに十分です。 </td></tr><tr><td>二次標識抗体</td><td> PBSでの競争のステップで使用する：アルカリフォスファターゼで標識抗マウスIgG（H + L）を1:100（V V）が希釈される。 </td><td> 10mlの最終容量のPBSで100μlの抗体ストック溶液は、25の規格及び/またはサンプルを分析するのに十分です。この溶液は使用時の瞬間に新しく調製する必要があります。 </td></tr></table>装置<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td>磁性粒子コンセントレータ：MPC ® - S </td><td> DYNAL </td><td></td></tr><tr><td> PalmSensの楽器</td><td> PalmSens </td><td> PalmSens Liteは、シリアルケーブル接続しているPCのラップトップおよびマルチプレクサのオプションのソフトウェアで提供</td></tr><tr><td> CH8 PalmSensマルチプレクサ</td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> 8チャンネルマルチプレクサの電気的接触</td><td>ハンドメイド</td><td></td></tr><tr><td> eightスクリーン印刷電極（SPEは）とストリップ</td><td>ハンドメイド</td><td></td></tr><tr><td>電極ストリップのために特別に設計サポート</td><td>ハンドメイド</td><td> SPEの各作用電極表面の下に配置され、それぞれが8ネオジウム磁石が含まれています</td></tr><tr><td>校正済みマイクロタイターピペット</td><td>ギルソン</td><td></td></tr><tr><td>マグネチックスターラーとスターラーバー。 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーカー（100、50、20ml）に。 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>メスフラスコ（2ミリリットル）。 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2〜2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブ。 </td><td>エッペンドルフ</td><td></td></tr><tr><td> 5ミリリットルと15ミリリットルのファルコン™チューブ。 </td><td>ファルコン</td><td></td></tr><tr><td>実験室ボルテックスミキサー</td><td></td><td> proteic部品の変性を避けるために免疫学的なチェーンでHT2 - KLHでコーティングされたまたはリンクされた磁気ビーズを再懸濁するためにボルテックスミキサーを使用しないでください。 </td></tr><tr><td>実験室のオーブンやサーモスタット部屋</td><td></td><td>温度37 ± 3℃を維持することができるオーブンを選ぶ</td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

イムノアッセイは、より高価で時間のかかる定量的なHPLCやGC 1、食料品の危険なマイコトキシンのスクリーニング検出のための2つの方法への有効な代替手段です。このプロトコルでは、プラットフォームを感知するなど、免疫化学チェーン3とスクリーン印刷電極の固体支持体として磁性ビーズの使用に基づいて、リンクされた免疫アッセイを作製し、電気化学的競争力のある酵素を尋問する方法を示します。 提案手法では、HT - 2とT - 2毒素の総量、トリコテセンの家族と人間の健康4の大きな懸念の属するマイコトキシンを決定することを目的とする。 HT - 2とT - 2に向かって100％の交差反応性抗体のクローンの使用は、同時に同じような感度5で両方の毒素を検出することができます。 私たちの分析の最初のステップは、我々は磁気ビーズの表面にHT2 - KLH複合体の毒素を固定化コーティングのステップです。非固有の吸収を避けるために必要なブロッキングのステップ、後に、モノクローナル抗体の添加は、HT - 2とフリーHT - 2やT - 2試料中に存在するか、標準液に溶解固定化との間の競争が可能になります。 競争のステップの終了時に、固定化HT - 2にリンクされているモノクローナル抗体の量は、試料溶液中の毒素の量に反比例します。 アルカリホスファターゼ（AP）で標識二次抗体を特異的抗体と固定化HT - 2の間の結合を明らかにするために使用されます。最後の測定ステップは、スクリーン印刷された作用電極の表面に、特定のサンプル/標準溶液に対応する磁気ビーズ懸濁液のアリコートを、ドロップすることによって実行されます。磁気ビーズは、下に正確に配置磁石により固定化し、そして濃縮されていますスクリーン印刷電極。磁気ビーズとAPの基質との間のインキュベーションの2分後、酵素製品は、ポータブル機器（PalmSens）数秒以内の間隔で自動的にeight測定を開始することを用いて微分パルスボルタンメトリー（DPV）によって検出されます。

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ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

競争力のある免疫化学的方法に基づいて新たに開発されたスクリーニング方法を用いてトリコテセン（ヒトの健康に対する懸念のマイコトキシン）を検出すると、最終的な電気化学的検出が実証されているプロトコル。

ELIME（免疫磁気電気化学的にリンクされた酵素）マイコトキシンの検出方法

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

elime-enzyme-linked-immuno-magnetic-electrochemical-method-for

Research

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Biology

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

14.1K ビュー.  University of Rome, Tor Vergata. 競争力のある免疫化学的方法に基づいて新たに開発されたスクリーニング方法を用いてトリコテセン（ヒトの健康に対する懸念のマイコトキシン）を検出すると、最終的な電気化学的検出が実証されているプロトコル。

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Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

タンパク質のユビキチン化の検出

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

生物学

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

哺乳動物細胞での糖タンパク質からN -結合型糖鎖のパルス - チェイス分析

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

磁気変調バイオセンシングシステムを用いた生物学的アッセイの迅速な均質な検出

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

酵素酢酸キナーゼのアセテート形成活性の直接検出

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

宿主植物の揮発性物質のスクリーニングツールとしてElectroantennographicバイオアッセイ

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

定量PCRは、ホルマリン固定、パラフィン包埋された生検組織中のサイトメガロウイルスDNAの検出のための高感度かつ迅速な方法であり、

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

マルチ酵素ハイスループット遺伝的酵素スクリーニングシステムを用いたスクリーニング

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

洗浄剤と酵素を含まない方法を用いた組織全体からの核分離

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.