私たちは、優れた技術サービスとジョンラルフ、貴重なアドバイス、ディスカッション、およびポプラの木のサンプルのウィスコンシン大学のマシューロバートウェザーに感謝しています。この作品は、化学科学、地球科学およびバイオサイエンス部門、基礎エネルギー科学、科学局、米国エネルギー省（受賞なし。DE - FG02 - 91ER20021）と米国エネルギー省（DOE）による五大湖のオフィスによって資金を供給されたバイオエネルギー研究センター（DOE科学BERオフィスDE - FC02 - 07ER64494）。

1。細胞壁の分離<ol><li>挽く約60 - 70mgの空気またはretschmillを（1分、25 Hz）を使用して2ミリリットルザルスタットのスクリューキャップチューブで5.5 mm、ステンレス鋼ボールで乾燥植物材料を凍結。選択肢は、高スループットの研削やロボットと呼ばれるiWallを調剤の使用は、パートI 3に記載されています。 </li><li>細胞壁の分離の手順を続行する前に鋼球を取り除く 細胞壁の材料の準備の詳細なプロトコールは、第I部3に示されています。プロトコルの書かれた手順は、ここに完全を期すために。 </li><li> 1.5 70％エタノール水溶液のmlと徹底的に渦を追加する</li><li>ペレットに10分アルコール不溶性残渣を10,000 rpmで遠心分離</li><li>上清を吸引したり、デカントする</li><li>ペレットを再懸濁するために残渣にクロロホルム/メタノール（1:1 v / v）の溶液1.5mlを加え、よくチューブを振る</li><li> 10分間、10,000 rpmで遠心し、上清を吸引除去したり、デカントする</li><li>アセトン500 ULでペレットを再懸濁します</li><li> 35で空気の流れで溶剤を蒸発させる℃を乾燥するまで 必要に応じて乾燥試料は、さらに処理するまで室温で保存することができます。 </li><li>サンプル0.1 M sodiumacetate緩衝液pH 5.0を1.5 mlの再サスペンドペレットから澱粉の除去を開始する。 </li><li> 20分間ザルスタット管と熱を締めくくる。 80℃の加熱ブロックインチ</li><li>氷の上に、懸濁液を冷却する</li><li>ペレットには、次のエージェントを追加：0.01％Sodiumazideの35μlの場合（NaN 3）を、35μlのアミラーゼ（50μg/1mLH 2 O、バチルス属から、SIGMA）、17μlのプルラナーゼ（菌のacidopullulyticusから18.7単位; SIGMA） 。チューブと徹底的にボルテックスにフタを。 </li><li>懸濁液を37℃で一晩インキュベート°回転シェーカーでC。管を配向させる水平側近は改良混合。 </li><li> 100℃の熱サスペンション° C消化を終了するために加熱ブロックに10分間。 </li><li>遠心（10,000 rpm、10分）とを含む上清を可溶化されたでんぷんを破棄</li><li> 、1.5 mlの水を加えボルテックス、centriguation、および洗浄水をデカンテーションによって、残りのペレット3回洗浄する。 </li><li>アセトン500 ULでペレットを再懸濁します</li><li>乾燥するまで35℃の空気の流れ° Cで溶媒を蒸発させる。それはよりよい乾燥用スパチュラでチューブの材料を分割することも必要になる場合があります。 乾燥した材料は、単離された細胞壁（リグノセルロース）を提示。必要に応じて乾燥試料は、さらに処理するまで室温で保存することができます。 </li></ol> 2。マトリックス多糖類組成このメソッドは本質的にAlbersheim 1によって公表された方法を変更したものです。 <ol><li>壁材の単糖組成を決定するには、手またはiWall、ロボット研削や計量ロボットを用いたハイスループットな方法のいずれかで2ミリリットルstarstedtチューブに細胞壁物質2mgの重量を量る。 </li><li>内部標準としてイノシトール溶液（5mg/ml）の20μlのを追加。 2mgの細胞壁のサンプルでは、​​100μgのを追加することをお勧めします。 </li><li>チューブの底に細胞壁の材料を収集し、空気の流れの下で非常に優しいアセトンを蒸発させるためにアセトン250 ULで管壁を洗う。 </li><li>弱い酸加水分解のために各サンプルに2Mトリフルオロ酢酸（TFA）250 ulを加える。ない材料がチューブの壁にまで飛散されていないことを確認するために慎重にTFAを追加。 </li><li>しっかりとキャップ、121で90分間インキュベート加熱ブロックのC。 </li><li>氷上での加熱ブロックとサンプルを冷却します。 </li><li> 10分間10,000 rpmでチューブを遠心する。 </li><li>ペレットの材料を邪魔しないようにして作るガラススクリューキャップバイアルに単糖由来のマトリックス多糖類を含有する酸性上清の100μlを移す。ペレットは、以下の結晶セルロースのアッセイに使用することができます（3を参照。） </li><li>蒸発装置内の空気の気流下でガラス管でTFAを蒸発させる。 </li><li> 300μlの2 - プロパノール、渦を追加し、25℃蒸発° C（合計3回の繰り返し） </li><li>アルジトールアセテート誘導体化の手順の最初のステップは、それらに対応するアルジトールする単糖の還元を実行することです。この目的のために各乾燥した試料に水素化ホウ素ナトリウム溶液200μlを加える。新鮮な溶液を1M水酸化アンモニウム1mlのあたりの水素化ホウ素ナトリウムの10mgのを使用して、各時間を準備します。 </li><li> 1.5時間室温でガラスバイアルを残す</li><li>氷酢酸150 ulを加えることによってソリューションを中和する</li><li> 25渦と蒸発° C。 </li><li> 250μlの酢酸/メタノール（1:9、v / v）を、渦を追加し、25℃蒸発˚C </li><li> （3回の合計のために繰り返す）250μlのメタノールを加え、そして空気の気流下で蒸発</li><li>アルジトールのアセチル化のために、無水酢酸とピリジン50μlの50μlを加える121℃で20分間ジアミン、渦とインキュベートします加熱ブロックのC。 </li><li>氷のブロックのクールダウンサンプルは、ほぼ室温に温度の低下を待っている間。 </li><li>室温で空気中の穏やかな流れの下で試薬を蒸発させる。注意してください：アルジトールアセテート、揮発性の高いです。 </li><li>空気の下で200μlのトルエンを追加し、蒸発させる（X3） </li><li>最後のステップではアルジトールアセテートが抽出されます。最初に、酢酸エチルと軽く渦を500 ulを加える。 </li><li>水、キャップ管と渦の2 mlを加える。 </li><li>明確な別のレイヤーを取得するために5分間2,000 rpmでチューブを遠心（上に酢酸エチル、底の水） </li><li>インサート付きGC / MSバイアル​​に酢酸エチル層のピペット50μlの。 </li><li> GC -バイアルとキャップにアセトン100 ulを加えることにより希釈する。サンプル濃度が高すぎると試料量と希釈のボリュームは、GC / MSの過負荷を避けるために調整することができます。 GC / MS分析が直ちに行われない場合、GC -バイアルは、4℃で保存することができます</li><li>サンプルは、四重極MSが装備されているGCに注入し、しかし、水素炎イオン化検出器も適しています。スペルコSP - 2380（30ミリメートルX 0.25ミリメートル× 0.25μmの膜厚）の列が4分溶剤遅延と1.5ml/minの流量で使用されます。注入されたサンプルは、次の温度プログラムに供される：160時の初期ホールド℃で2分間、20℃〜200℃/分のランプ℃、5分間保持、20℃〜245℃/分のランプ° Cとホールド12分、270〜スパイク° Cおよび160 ° C 2.26の初期温度に冷却する前に5分間保持）ピークが基準の質量プロファイル及び/または保持時間で識別されます。。単糖類は、標準曲線に基づいて定量化されています。 </li></ol> 3。結晶セルロースのコンテンツこのメソッドは本質的にUpdegraf 8で記述されています。隔離された細胞壁物質（1を参照）または既に2M TFA（2.8参照）のどちらか、残りのペレットすぐに酸処理後の（2.8参照）またはTFAで処理されている壁材：この手順のための出発物質は数多くあります2 - プロパノールで洗浄し、乾燥されたペレット、。 <ol><li>アップダグラフの試薬のスクリューキャップ付きガラス管1ミリリットル（：硝酸：水、午前8時01分02秒V / V酢酸）にTFAペレットに追加します。 </li><li> 100℃の加熱ブロックにしっかりとキャップチューブ、渦、および熱℃で30分間。この治療の結果として、唯一の結晶セルロースは、ペレットに不溶のまま。 </li><li>室温やクーラーに氷の上にブロックでクールサンプル</li><li> 15分間10,000 rpmでサンプルを遠心</li><li>ペレットが乱れていないと削除されたペレットからの材料されていないことを確実に上清を捨てる。この目的のために約残す。チューブの上清の150μlを。 </li><li> 、遠心分離機を振る、水1.5mlを追加し、上記で行ったように上清を捨てる</li><li>洗浄手順のアセトン1.5mlを用いてさらに3回繰り返す</li><li>空気乾燥した空気と非常に穏やかにペレット、または一晩ベンチに乾燥させる</li><li>ペレットは、（結晶セルロース）Saemanの加水分解と呼ばれるもので、今グルコースに完全に加水分解される。この目的は、ザルスタットのチューブに175μlの72％の硫酸を加えるために</li><li>別の15分間、30分間、渦とインキュベート室温でインキュベート</li><li> 825μLの水と渦を追加する</li><li> 5分間10,000 rpmでサンプルを遠心する。チューブに残っているいくつか茶色の不溶性物質、リグニン、あるかもしれません。 </li><li>上清のグルコース含有量は、比色アントロンアッセイを用いてアッセイされる。このアッセイは96ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレートで実行されます。 </li><li>標準曲線は、1mg/mlグルコースの株式を（0 ° Cで保存されている）を使用して、0、2、4、6、8、10 ulのピペッティングして0、2、4、6、8、および10μgの規格を重複作成するための別の適切なウェルに。水で100μlを各ウェルに埋めます。 </li><li>別々のセルに、標準のと同じマイクロタイタープレート上に各サンプルの上清10μlと水90 mlを加える。 </li><li>作りたてのアントロン試薬（濃硫酸に溶解したアントロン、2 mgをアントロン/ mlの硫酸）の200μlを加える</li><li> 80℃30分間熱板オーブンで° C（アルミのヒートスプレッダ）。グルコースを含む試料は黄色から青緑色に変わります。 </li><li>室温にプレートが冷ますと徹底的に振る。 </li><li>マイクロタイタープレートリーダーを用いて625ミリメートルで、プレートの吸収を読み取る。 </li><li>グルコース（それゆえ、結晶セルロースの含有量）は同じプレート上で確立された標準曲線と比較して吸光度に基づいて計算されます。 </li></ol> 4。代表的な結果壁の解析の例を図2に示す。この場合にはポプラの幹（木）は、プロトコルのセクションで概説、様々な手順で分析した。行列POlysaccharide組成物を植物細胞壁における典型的な砂糖の存在を識別する例のクロマトグラムで強調表示されている、フコース、ラムノース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノースとグルコース（および内部標準イノシトール）。高キシロースの含有量によって示されるようにポプラの主要なヘミセルロース成分はキシランである。しかし、これらの糖の存在量は、原料のused4によって異なります。この分析でグルコースは、ヘミセルロースのキシログルカンとアモルファスセルロースから導出されます。分析によるデータは、モル％またはUG / mgの壁材（または乾燥重量）として提示することができます。結晶セルロースの含有量は自明である、一つの壁乾燥重量の20〜50％の間の値を期待することができます。ここに示された結果に基づいており、パートI3にポプラ​​材のリグノセルロース系組成は21％のリグニン、30％のヘミセルロース、および41％の結晶セルロースである。残りは灰になる。 <img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：。リグノセルロースの分析の概要細胞壁（リグノセルロース）は、原油乾燥植物材料から分離されています。壁材は、アリコートに重み付けをし、様々なアッセイのために分割されます。マトリックス多糖組成物は、弱酸（2M TFA）と壁材を扱う彼らのアルジトールアセテートに結果の可溶化単糖類を誘導体化し、GC - MSによる分析の後に確立されます。弱い酸処理の残渣を背後のみ不溶性crystllineのセルロースを残し、いわゆるアップダグラフの試薬で洗浄する。セルロースを硫酸で溶解し、グルコースの含有量を決定する比色分析によって定量化される。パートI 3で説明したように並行して、リグニンの含有量と組成を決定することができます。 <img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：ポプラ（ ポプラtremoloides）からポプラ樹木木材チップの包括的なリグノセルロースの分析は、記載されたプロトコールを行った。 左上：マトリックス多糖組成物;フコースフコース、RHAラムノース、荒アラビノース、キシロースXYL、マンノースマン、ギャルガラクトース、グルコースのグルコース、イノシトール内部標準。

<ol>
	<li>Albersheim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+analysis+of+sugars+in+plant+cell+wall+polysaccharides+by+gas-liquid+chromatography.">A method for the analysis of sugars in plant cell wall polysaccharides by gas-liquid chromatography.</a> Carbohydr. Res. 5, 340-340 (1967).</li><li>Carroll, A., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulosic+Biofuels.">Cellulosic Biofuels.</a> Annu Rev Plant Biol. 60, 165-165 (2009).</li><li>Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass),+Part+I:+Lignin.">Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part I: Lignin.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li><li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels.">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).</li><li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant-cell+walls.">Toward a systems approach to understanding plant-cell walls.</a> Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).</li><li>Teeri, T. T., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterisation+and+applications+of+enzymes+from+the+wood-forming+tissues+of+poplar:+Glycosyl+transferases+and+xyloglucan+endotransglycosylases.">Discovery, characterisation and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endotransglycosylases.</a> Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).</li><li>UPDEGRAF, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEMIMICRO+DETERMINATION+OF+CELLULOSE+IN+BIOLOGICAL+MATERIALS.">SEMIMICRO DETERMINATION OF CELLULOSE IN BIOLOGICAL MATERIALS.</a> Anal. Biochem. 32 (3), 420-420 (1969).</li></ol>

記載された方法は、リグノセルロース系植物バイオマスの組成の迅速な定量的評価を有効にしてください。方法は、すなわちマトリックス多糖類ヘミセルロースの糖組成、結晶セルロースの含有量を含むような材料の組成の決定が可能になります。お一人様、様々な分析手法のスループットが異なります。ここに記載されているプロトコルを使用して、20サンプルは、結晶セルロースの含有量のための行列の多糖組成物および30で処理することができます。データに最適な原料作物の定量的な性質のために、様々なまたは遺伝子型は、バイオ燃料生産のためのその適合性の観点で評価することができる。

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Trifluoroacetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T6508</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>myo-Inositol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I5125</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Borohydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>213462</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pyridine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J.T. Baker</td>
<td>3348-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetic Anhydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>320102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectromax Plus 384</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Plus384</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>7890A GC/5975C MSD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5.5mm Stainless Steel Balls</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Salem Ball Company</td>
<td>(N/A)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96 well plate heat spreader</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biocision</td>
<td>Coolsink 96F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Retsch Mill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>TissueLyser II</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heating block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Techne</td>
<td>Dri-block DB-3D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sample concentrator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Techne</td>
<td>FSC400D</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part ii: carbohydrates

産業と社会のための再生可能エネルギー、カーボンニュートラル、そして持続可能な原材料の必要性は、21世紀の最重要課題の一つとなっている。これは輸送用液体燃料の生産のための工業用原料としての植物製品の使用に関心を再燃させたている<sup&gt; 2</sup&gt;このようなbiocomposite材料として他の製品<sup&gt; 6</sup&gt;。植物バイオマスは地球上で最大の未開発の埋蔵量の一つである<sup&gt; 4</sup&gt;。それは主にセルロース、様々なヘミセルロース、およびポリフェノールリグニンを含むエネルギーリッチなポリマーで構成されている細胞壁で構成されています<sup&gt; 5</sup&gt;そのため、時にはリグノセルロースと呼ばれる。しかし、植物の細胞壁は、壁は強度とプラント全体の構造的完全性に広く貢献して劣化に手に負えないように進化してきた。その必要な剛性にもかかわらず、細胞壁は、代謝的に活性であり、そのような植物の成長や分化などの多くの細胞活動において重要な役割を果たしている非常に動的なエンティティです。<sup&gt; 5</sup&gt;。壁の様々な機能が原因で、単一工場内の異なる植物種や細胞タイプの城壁内に巨大な構造の多様性がある<sup&gt; 4</sup&gt;。したがって、作物種、作物​​の品種、又は植物組織がバイオリファイナリーのために使用されているものによっては、化学/酵素的プロセスと液体バイオ燃料への様々な糖のその後の発酵による解重合のための処理手順を調整し最適化する必要があります。この事実を支える植物のバイオマス原料の徹底した特性評価のための必要性。ここでは、リグノセルロースの組成の決定を可能にし、ハイスループット分析への培地（図1）を受けやすい包括的な分析方法を説明します。このメソッドはdestarched細胞壁の材料を準備してから始まります。結果として得られるリグノセルロースは、そのヘミセルロースの単糖類組成と他の行列polysaccharides1、及び結晶セルロースのその内容を決定するために分割されます<sup&gt; 7</sup&gt;。リグノセルロース系バイオマスのリグニン成分を分析するためのプロトコルは、私はパートで説明されています<sup&gt; 3</sup&gt;。

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Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

植物バイオマスは、バイオ燃料の生産に使用できる主要なカーボンニュートラルな再生可能な資源です。植物バイオマスは、主に細胞壁、リグノセルロースと呼ばれる構造的に複雑な複合材料で構成されています。ここでは、壁由来の炭水化物の含有量と組成の包括的な分析のためのプロトコルについて説明します。

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートII：炭水化物

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

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Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

Unit 1

Plant Cell Structure and Organization

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29.9K ビュー.  Michigan State University (MSU). 植物バイオマスは、バイオ燃料の生産に使用できる主要なカーボンニュートラルな再生可能な資源です。植物バイオマスは、主に細胞壁、リグノセルロースと呼ばれる構造的に複雑な複合材料で構成されています。ここでは、壁由来の炭水化物の含有量と組成の包括的な分析のためのプロトコルについて説明します。

ビデオ: Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 1 of 3.

ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

生物学

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 2 of 3.

ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 3 describes the process of fluorescently labeling the amplified RNA from both host and viral samples by amino allyl coupling of dyes. Part 3 of 3.

ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その3

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

人間の膵島単離：パートII：ヒト膵島の精製と​​文化

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートI：リグニン

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find cost-effective and sustainable solutions has become a topical and critical task. Lignocellulosic biomass is poised to become the primary source of biomass for the conversion to liquid biofuels1-6. However, the recalcitrance of these plant cell wall materials to cost-effective and efficient degradation presents a major impediment for their use in the production of biofuels and chemicals4. In particular, lignin, a complex and irregular poly-phenylpropanoid heteropolymer, becomes problematic to the postharvest deconstruction of lignocellulosic biomass. For example in biomass conversion for biofuels, it inhibits saccharification in processes aimed at producing simple sugars for fermentation7. The effective use of plant biomass for industrial purposes is in fact largely dependent on the extent to which the plant cell wall is lignified. The removal of lignin is a costly and limiting factor8 and lignin has therefore become a key plant breeding and genetic engineering target in order to improve cell wall conversion.
Analytical tools that permit the accurate rapid characterization of lignification of plant cell walls become increasingly important for evaluating a large number of breeding populations. Extractive procedures for the isolation of native components such as lignin are inevitably destructive, bringing about significant chemical and structural modifications9-11. Analytical chemical in situ methods are thus invaluable tools for the compositional and structural characterization of lignocellulosic materials. Raman microscopy is a technique that relies on inelastic or Raman scattering of monochromatic light, like that from a laser, where the shift in energy of the laser photons is related to molecular vibrations and presents an intrinsic label-free molecular "fingerprint" of the sample. Raman microscopy can afford non-destructive and comparatively inexpensive measurements with minimal sample preparation, giving insights into chemical composition and molecular structure in a close to native state. Chemical imaging by confocal Raman microscopy has been previously used for the visualization of the spatial distribution of cellulose and lignin in wood cell walls12-14. Based on these earlier results, we have recently adopted this method to compare lignification in wild type and lignin-deficient transgenic Populus trichocarpa (black cottonwood) stem wood15. Analyzing the lignin Raman bands16,17 in the spectral region between 1,600 and 1,700 cm-1, lignin signal intensity and localization were mapped in situ. Our approach visualized differences in lignin content, localization, and chemical composition. Most recently, we demonstrated Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana with lateral resolution that is sub-&mu;m18. Here, this method is presented affording visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species without staining or labeling of the tissues.

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

A method based on confocal Raman microscopy is presented that affords label-free visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species.

ラベルフリーその場で</em植物細胞壁の木化の>イメージング

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

マイクロアレイを用いた植物細胞壁ポリマーの糖鎖プロファイリング

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;サスペンション細胞培養

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em&gt;シロイヌナズナ</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...