Name: ビデオ: Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth
Uploaded: 2010-05-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 11 s

この方法の開発は、カリフォルニア州のたばこ関連疾患の研究プログラム、再生医療のためのカリフォルニア工科大学、およびUCR（でビデオバイオインフォマティクスに関するNSF IGERT助成金（＃0903667）からの資金調達によって可能となった<a href="http://www.cris.ucr.edu/IGERT/index.php">http://www.cris.ucr .edu / IGERT / index.phpを</a> ）。サブリナリンが大学院課から博士論文のフェローシップでサポートされている、ショーンFortenoはNIH MARCフェローシップでサポートされており、Shruthiサティは大学院課のフェローシップでサポートされています。我々は数字を準備する彼女の助けのためのアンナTrtchounianに感謝しています。我々はまた、CL -クワントソフトウェアを使用する方法を私達に教えるためにサムAlworthとネッドJastrombに感謝。

その1：実験方法ビデオデータは、情報の豊富さが含まれています。しかし、この情報は頻繁に抽出することは困難であると人間が手作業で行われ、完了するスタッフの時間の多くの時間を必要とする可能性がある場合。人間による手動の分析はまた、解釈し、エラーの変化の対象となります。ビデオバイオインフォマティクスは、ビデオ画像から特定のデータをマイニングするためのコンピュータソフトウェアの使用を含む。分析のこの方法は迅速であり、分析は人間が手作業で行われている場合に発生するエラーを排除することができます。この記事の目的は、ビデオバイオインフォマティクスの手法を用いて、ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長を定量化する方法を示すことです。 本論文では、時間経過のビデオ画像は、細胞の複数のフィールドが（図1）時間をかけて撮像を可能にするニコンBioStation CTのインキュベーションのユニットを使用して収集した。このレポートで説明されている方法は、設定微細な任意のビデオによって収集された映像データに適用可能である。 48時間、12ウェル組織培養プレートでH9 hESCの我々の実験デザインで、私たちはメッキ。このインターバルの間に、コロニーを完全に接続し、マトリゲル上に展開させた。その後、添付されたヒトES細胞のコロニーとプレートBioStation CTに転送し、さらに48時間インキュベートした。 BioStationにしながら、コロニーの画像は7分間隔で採取し、後でタイムラプスビデオシーケンスを作成するために使用されていました。各コロニーのためのビデオは、CL -クワントソフトウェアで開発したビデオバイオインフォマティクスのレシピを使用してコロニーの成長を定量化するために分析した。 CL -クワントソフトウェアで作成されたレシピを使用して行う分析は、手動でAdobe Photoshopを使用して真実性について調べた。 パート2：添付されたヒトES細胞のコロニーの準備<ol><li>マトリゲルでコートした6ウェルプレートにヒトES細胞の成長、そして一度、70％コンフルエントに達すると、次のように12ウェルマトリゲルコーティングしたプレートの5ウエルに6ウェルプレートの1つのウェルをreplate。 </li><li>よく含まれているヒトES細胞から培地を吸引除去する。 </li><li> PBS 1mlのと2倍よくすすいでください。 </li><li> 37℃および5％CO 2を 1分間Accutaseとインキュベートの1ミリリットルを追加。 </li><li>ウェルに10月12日ガラスビーズを追加し、コロニーは完全にウェルの底からデタッチされるまで静かにプレートを振る。 </li><li> mTeSR培地またはMEF馴化培地1mlを使用してAccutaseを中和する。 </li><li> 3分間200グラムで15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を遠心してください。 </li><li>新鮮mTeSR媒体の500μLで上清とブレークペレットをデカント。 </li><li> 12ウェルプレートの各ウェルにhESCのサスペンションのプレートの滴下100μlの。 </li><li>ロックプレートは前後に軽くし、光学顕微鏡下での文化を観察。細胞塊は均等にプレート全体に分散されていることを確認します。 </li><li>バックインキュベーターに12ウェルプレートを置きます。 </li><li>ヒトES細胞を48時間装着し、成長することができます（より短い時間を使用することができる）。 </li><li> 48時間後、培地をデカントし、アタッチされていない細胞を除去するためにPBSの500ulでウェルを洗浄。 </li><li>各ウェルにmTeSRの培地を1mlを追加。 </li><li>コメント：直ちにインキュベーター/ビデオイメージングのための顕微鏡にプレートを置く。 </li><li>タイムラプス画像の収集を開始。他のコロニーに成長する可能性がない離散単一のコロニーを持つフィールドを選択しよう。 </li><li>培養してヒトES細胞をセットアップするための他の方法は、上記のプロトコルの代わりに使用することができます。 </li></ol>パート3：ビデオバイオインフォマティクス CL -クワントのソフトウェアは、順番に実行するときに時間をかけて各コロニーに対してミクロンのピクセル数または領域を決定する三つの&quot;レシピ&quot;を作成するために使用されました。 3つのレシピは順番に、このアプリケーション用に構築されているセグメンテーション、強化、および測定を含む。 CL -クワントソフトウェア/レシピの開発を使用してhESCのコロニーの成長の分析： <ol><li> セグメンテーションのレシピが最初に作成されます。 </li><li>ビデオが使用可能であることを確認してビデオ全体をスキャンします。コロニー全体が視野に残っていると他のコロニーはフィールドを入力しないことを確かめるためにチェックします。 </li><li>セグメンテーションウィザードを開き、&quot;次へ&quot;ボタンをクリックしてください。 </li><li>正しいイメージのチャンネルを（すなわち、位相、緑、赤、など）を選択し、&quot;次へ&quot;ボタンをクリックしてください。 </li><li> 3つの選択肢のうち&quot;ソフトなマッチング&quot;を選択し、&quot;次&quot;をクリックします。 </li><li>一般的に画像コロニーの中央部に植民地の外縁上の領域を周回することによって&quot;希望&quot;の領域を選択します。 <ul><li>この領域はできるだけ小さくする必要がありますが、全体の植民地の代表です。 </li><li>位相差顕微鏡を使用する場合、ソフトによって正確なコロニーを選択するためのコロニーの周囲にハローを含めるようにしてください。 </li><li>異なる表示される場合があります関心の1または2の地域を選ぶピクセルは、コロニー内のパターンが、不正確なマスクのアプリケーションにつながる可能性が多すぎる&quot;欲求&quot;を選択しないでください。 </li></ul></li><li> &quot;次へ&quot;ボタンをクリックします。 </li><li>植民地ではなく背景の部分の一部ではない画像上の領域を周回することで地域を&quot;希望しない&quot;を選択します。これらはあなたが抑制し、そのような残骸や死細胞などのアーティファクトのピクセルを含むようにしたいパターンを持っている領域です。 &quot;次&quot;をクリックします。 </li><li>あなたが抑制したい領域を周回することで&quot;背景&quot;を選択します。 <ul><li> &quot;したくない&quot;と&quot;背景&quot;地域がそのバックグラウンドが異なる均一とすべてのフレームに表示する可能性が高いはずです。 </li><li>一般的に我々は、コロニーの周りの灰色の背景を選択します。 </li></ul></li><li> &quot;次へ&quot;ボタンをクリックします。 </li><li>色付きのマスクは、興味のある領域（図2A）上に表示されるべきである。 </li><li>マスクは、正確に興味のある領域をカバーしていない場合、セグメントのしきい値の範囲は、（ソフトウェアの画面の右下にある）に増加または減少させることもできます。 </li><li>必要に応じて、セグメンテーションウィザードはさらにマスク領域を微調整するプロンプトが表示されます。 </li><li>あなたがマスクを変更したい場合、&quot;ソフトのマッチング領域を更新する&quot;を選択します。これは、&quot;したくない&quot;、&quot;する&quot;、または&quot;背景&quot;の領域を変更することができます。 </li><li>マスクが十分な場合には、&quot;しきい値を適用し、私のマスクを保存&quot;を選択し、&quot;次へ&quot;ボタンをクリックしてください。 </li><li>マスクは、異なる色で表示されます。 </li><li> &quot;フィニッシュ&quot;を選択します。 </li><li>レシピは、ソフトウェアの右上隅に表示されるべきである、そしてそれが&quot;セグメンテーションのレシピ&quot;と呼ばれるべきものです。 </li><li>あなたが右クリックし&quot;名前の変更&quot;で希望の場合レシピの名前を変更します。 </li><li>スポットチェック用に、右クリックし、&quot;レシピを適用&quot;の上にマウスを置きます。 </li><li>メニューでは、スポットのレシピをチェックするときに使用したいフレーム数を選択できるようにすることが表示されます。マスクの位置の精度を確認発見するごとに10フレームのためのレシピを実行します。 </li><li>マスクは、小さな不要な領域または破片の部分をピックアップすると、関心の領域にマスクのフィッティングを改善するために&quot;強化のレシピ&quot;を作成することができます。 </li><li> 強化のレシピを作成するには、右の&quot;強化のレシピ&quot;フォルダをクリックし、&quot;新しい&quot;をクリックしてください。新しい拡張のレシピが表示されるはずです。 </li><li>視野（FOV）の元のフィールドから、画像の右側にある&quot;トグルの拡張モジュール&quot;ボタンをクリックしてください。正しいものを識別するために、ツールバーのアイコン上にマウスを移動します。 </li><li> &quot;ラベル表示&quot;ドロップダウンメニューを選択してください。 </li><li> &quot;ラベリング4接続&quot;を選択します。 </li><li> &quot;ラベリング4 connected2&quot;を選択します。 </li><li>新しいタスクバーが表示されるはずです。 </li><li>セグメンテーションのレシピから、初期マスク（mask0）を取得し、&quot;入力&quot;ボックスにドラッグします。 </li><li>バーが&quot;＃入力のマスクを&quot;表示する必要があります。 </li><li>マスク0アイコンに&quot;＃入力マスク&quot;でアイコンをドラッグします。 </li><li>タスクバーの&quot;最小サイズ&quot;を見つけ、関心領域のみが表示されるまで数を調整します。あなたが各継手の試験を通じて、&quot;実行&quot;をクリックすることを確認してください。 </li><li>一旦あなたがあなたの最小サイズの調整に満足している、以前に作成した&quot;強化のレシピ&quot;をクリックしてください。 （図2B） </li><li>画面の下部に、&quot;レシピに保存&quot;を選択します。 </li><li>ソフトウェアは、現在&quot;選択されたレシピを上書き？&quot;、&quot;はい&quot;を選択するプロンプトが表示されます</li><li>スポットチェックするセグメンテーションのため上記と同じ手順を使用して強化のレシピをチェック見つける。 </li><li>セグメンテーションと強化のレシピに満足している場合、右側のツールバーにある&quot; 測定のテンプレートを作成&quot;を選択します。 </li><li>必要に応じてするテンプレートの名前を変更します。 </li><li>測定のテンプレート]ウィンドウで、クリップアートのセルの数字の上にカーソルを移動します。 Ctrlキーを押しながらセルを選択します。 </li><li>チェックを外して&quot;デフォルトパラメータ&quot;と&quot;形態&quot;の下のチェック&quot;の領域のパラメータ&#39;。 </li><li> &quot;テンプレート&quot;ウィンドウを終了します。 </li><li>測定のレシピで作成されたアイコンを選択します。 </li><li>レシピの名前を変更します。 </li><li>に移動し、右上隅にある&quot;テンプレート&quot;タブを選択します。 </li><li>ドラッグして、測定ウィンドウにドラッグして、以前に作成した測定テンプレートをドロップします。 </li><li>続行するには&quot;はい&quot;をクリックします。 </li><li>測定レシピ]ウィンドウで、選択して&quot;全細胞&quot;、&quot;チャンネルマッピング&quot;。 </li><li> SELECT&#39;マスクのマッピング&quot;。 </li><li>その後、強化されたマスクのための&quot;全セルのオプションを選択します。 </li><li>メインウィンドウでレシピのタブの下にある&quot;測定レシピ&quot;を選択してください。 </li><li>測定レシピのウィンドウ内の&quot;Save&quot;アイコンを選択してください。 </li><li>その後、ウィンドウを閉じます。 </li><li>今、&quot;FOV&quot;を閉じて開き直します。 </li><li>右の&quot;レシピ&quot;アイコンを選択&quot;ロックのレシピのリスト&quot;をクリックしてビデオデータを順番にレシピを実行する。 </li></ol>パート4：Photoshopのソフトウェアを使用して、レシピの正確さの確認 （CL -クワントソフで作成されたレシピを検証するために）は、同じデータをAdobe Photoshopで手動で解析することができます。この分析では、10回ごとのフレーム（毎70分の時点で）48時間以上のコロニーの大きさを測定するために分析した。 <ol><li> Adobe Photoshopでコロニーの画像のフレームを開きます。 </li><li>ツールバーにある魔法の杖ツールをクリックしてください。 </li><li>フィールド全体が植民地の地域を除いて覆われているように植民地の周辺をクリックしてください。 </li><li>ツールバーの&quot;はクイックマスクモードで編集&quot;とコロニーが選択されているように植民地をクリックします。 </li><li>コロニーの周囲に点線のラインは、コロニーの周辺部とではない、その中に右に収まることを確認してください。点線が周囲にない場合は、それに応じて上部のツールバーに許容値を変更します。 </li><li>メニューをプルダウンし、&quot;ヒストグラム&quot;をクリック&quot;ウィンドウ&quot;に移動します。 </li><li>ときにキャッシュ= 1ピクセルの値を書き留めます。キャッシュが2の場合は、クリックに&#39;！&#39;キャッシュを1に変更してから、ピクセルの値をメモする。 </li><li> 10回ごとのフレームのため、上記プロセスを繰り返します。必要に応じて、より少ない合計フレームを使用することができます。 </li><li> PhotoshopとCL -クワントソフトウェアを使用して収集されたデータは、一緒にプロットすることができます。 CL -クワントレシピが真実なら、PhotoshopとCL -クワント分析のための曲線は（図3-5）非常に似ている必要があります。 </li><li> CL -クワントで開発したレシピが真実なら、彼らは確実に他のビデオデータに適用することができます。 </li><li>この分析でビデオバイオインフォマティクスを使っての値は、セグメンテーション、強化、および測定のレシピを開発し、検証されれば、彼らははるかに急速に、より正確にPhotoshopを使用して、人間よりも解析が実行されるためです。 </li></ol>代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：BioStation CTでの成長の48時間の間にさまざまなタイミングでフレームを示すhESCのコロニーのフィルムストリップ。フレームは、7分間隔で採取された。 <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：セグメンテーションのレシピによって植民地に置かれたマスクを使ってヒトES細胞の（A）イメージ。破片と背景の領域も強化レシピが評価の精度を向上させるために必要とされることを示すマスクされています。 （B）増強後の&quot;A&quot;に示すように、同じコロニーのイメージが実行されています。マスクは今だけ植民地を選択し、ノイズは選択から除外されています。 <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig3.jpg" alt="図3" /> 図3：CL -クワントソフトウェアとPhotoshopを使用して決定されるように48時間以上（ピクセル単位）コロニーの大きさの増加を示すグラフ。このグラフはコロニーがさまざまなサイズで起動することを生データとを示している。また、測定の両方の方法がよく一致していることを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig4.jpg" alt="図4" /> 図4：48時間以上のコロニーの大きさのパーセントの増加を示すために正規化した後、図3と同じデータを示すグラフ。これは成長率に関係なく開始コロニーの大きさのと分析の両方の対策が同様の結果がでてくるような似ていることを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig5.jpg" alt="図5" /> 図5：図4の正規化されたデータのための手段を示すグラフ。このグラフは明らかにビデオバイオインフォマティクス（CL -クワントソフト）とPhotoshopを使用して、レシピが真実であることを確立行う分析の間に良い一致を示しています。フレーム325のPhotoshopデータの領域のわずかな悪化は、Photoshopの分析に含まれていないいくつかの動画によるものです。

ビデオバイオインフォマティクスのツールは、急速にビデオ画像からデータを抽出するために強力です。ヒトES細胞のコロニーの成長を定量化するための我々のプロトコルは、生物学的問題にビデオバイオインフォマティクスのあるアプリケーションを示しています。この方法は定量的であり、個々のヒトES細胞のコロニーからのデータを明らかにする興味深い機能を備えています。ビデオバ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>mTeSR1 Human Embryonic Stem Cell Maintenance Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>05850</td>
<td>or any suitable medium for hESC culture.</td>
</tr>
<tr>
<td>BD Matrigel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>356234</td>
<td>or other suitable substrate.</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12 Basal Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-032</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Accutase Enzyme Cell Detachment Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>eBioscience</td>
<td>00-4555-56</td>
<td>or other suitable detachment enzyme.</td>
</tr>
<tr>
<td>3mm Glass beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>11-312A</td>
<td>optional.</td>
</tr>
<tr>
<td>12-well Tissue Culture Plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353043</td>
<td>or any other plate format.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nikon BioStation CT/IM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or other incubator/microscope suitable for collecting video data.</td>
</tr>
<tr>
<td>CL-Quant software (Nikon) and/or Photoshop (Adobe).</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

video bioinformatics analysis of human embryonic stem cell colony growth

ビデオデータは複雑であり、多くの画像、ビデオ素材からマイニング情報で構成されているため、コンピュータソフトウェアの助けなしに行うことは困難です。ビデオバイオインフォマティクスは、デートマイニングと分析を実行するコンピュータソフトウェアを使用してビデオ画像からの時空間データを抽出するための強力な定量的なアプローチです。この記事では、我々には、ビデオ画像のためのカメラを搭載したニコンBioStation CTインキュベーターで収集したタイムラプスビデオを分析することにより、ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）の成長を定量化するためのビデオバイオインフォマティクスの手法を紹介する。我々の実験では、マトリゲルにアタッチされていたヒトES細胞のコロニーは、BioStation CTで48時間撮影されました。これらのコロニーの成長率を決定するために、レシピは、ユーザーがビデオ画像からのデータの様々なタイプを抽出することができるCL -クワントソフトウェアを使用して開発されました。正確にコロニーの成長を評価するために、3つのレシピを作成しました。植民地と背景、正確にビデオシーケンス全体にコロニーを定義する2番目の拡張像、およびサードへの最初のセグメント化された画像は、時間をかけて植民地でピクセル数を測定した。 3つのレシピが48時間にわたって個々のヒトES細胞のコロニーの成長率を分析するBioStation CTで収集した映像データを順番に実行されました。 CL -クワントレシピの真実性を確認するには、同じデータをAdobe Photoshopソフトウェアを使用して手動で分析した。データは、CL -クワントのレシピを用いて得られたし、Photoshopを比較したところ、結果はCL -クワントレシピが真実であったことを示す、実質的に同一であった。ここで説明する方法は、ヒトES細胞やコロニーに成長する他の細胞の増殖率を測定するために任意のビデオデータに適用することができる。さらに、他のビデオバイオインフォマティクスのレシピは、マイグレーション、アポトーシス、および細胞接着などの他の細胞プロセスのための将来的に開発することができます。

Watch this Scientific Journal Video about Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth at JoVE.com

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

ビデオバイオインフォマティクスは、自動処理、分析、理解、および顕微鏡ビデオから抽出した生物学的な時空間データのデータマイニングです。この記事の目的は、ビデオバイオインフォマティクスの手法を用いて、ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長を測定するための方法を示すことです。

ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長のビデオバイオインフォマティクス解析

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

video-bioinformatics-analysis-human-embryonic-stem-cell-colony

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K ビュー.  University of California. ビデオバイオインフォマティクスは、自動処理、分析、理解、および顕微鏡ビデオから抽出した生物学的な時空間データのデータマイニングです。この記事の目的は、ビデオバイオインフォマティクスの手法を用いて、ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長を測定するための方法を示すことです。

ビデオ: Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts of cell culture, and tend to acquire karyotypic abnormalities with high population doublings.  Proper passaging is essential for maintaining a healthy, undifferentiated, karyotypically normal HuES human embryonic stem cell culture.  First, an expanding culture is washed in PBS to remove residual media and cell debris, then cells are overlaid with a minimal volume of warm 0.05% Trypsin-EDTA.  Trypsin is left on the cells for up to five minutes, then cells are gently dislodged with a 2mL serological pipette.  The cell suspension is collected and mixed with a large volume of HuES media, then cells are collected by gentle centrifugation.  The inactivated trypsin media mixture is removed, and cells resuspended in pre-warmed HuES media.  An appropriate split ratio is calculated (generally 1:10 to 1:20), and cells re-plated onto a 1-2 day old plate containing a monolayer of irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells.  The newly seeded HuES culture plate is left undisturbed for 48 hrs, then media is changed every day thereafter.  It is important not to trpsinize down to a single cell suspension, as this increases the risk of introducing karyotypic abnormalities.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin. Brought to you by JoVE.

トリプシンで継代色合いヒト胚性幹細胞、線

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

生物学

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

ヒト胚性幹（ES）細胞の増殖

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

免疫手術でヒト胚性幹細胞の導出

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

分離と成人ヒト内皮コロニー形成前駆細胞の大規模拡張

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（MSCs）と血管内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）の単離および動物血清自由膨張

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

ヒト胚性幹細胞を凍結融解

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.