高スループットのプロトコルである酵母細胞は、何千ものマイクロコロニーの成長と遺伝子発現を同時に追跡することができます。株間、環境間、さらには共有環境で増殖した遺伝的に同一の細胞間の差を定量化することができる。このプロトコルは、遺伝子発現レポーターの平均成長率と平均蛍光強度の正確な推定値を生み出します。
また、多くの個体のマイクロコロニーがアッセイされるため、成長と発現値の分布全体の正確な推定値が得られます。このプロトコルは、実験プレートの調製とイメージング用の細胞の調製の2つの主要なステップに従います。細胞は希釈および混合の直後にめっきされなければならない。
そのため、最初に実験プレートを設定することをお勧めします。このプロトコル全体で細胞が繰り返し混合されていることに気づくでしょう。実験当日、顕微鏡画像に現れる可能性のある結晶を除去するために、アッセイに使用されるすべての培地および他の溶液は、すでに無菌であっても2ミクロンのフィルターで濾過する必要があります。
これには、実験メディアとコンカナバリンA溶液が含まれます。次に、顕微鏡板を準備します。井戸のガラス表面を破片や傷から取り除くために、常にプレートの下に糸くずと静的なフリーワイプを保管してください。
滅菌ベンチで滅菌技術を使用してください。顕微鏡プレートの各ウェルに1XコンカナリンA溶液とピペット200マイクロリットルの25ミリリットルをフィルター。ピペットを安定させ、適切な高さを確保することをお勧めします。
コンカナリンAがウェルの底を均等にコーティングするのを防ぐことができる気泡を除去するために、411倍Gで2分間、糸くずと静的なフリーワイプを備えた顕微鏡プレートを遠心分離する。コンカナジンA溶液を含むプレートを1〜2時間休ませます。実験全体で一貫性を保つ。
コンカナバリンAインキュベーションの後、ここで示すように、吸引装置で、または強制的にプレートから溶液を投棄することによって、96ウェルプレートからコンカナバリンAをクリアします。いくつかの液滴が残ります。次に、各ウェルに400マイクロリットルの無菌水を加えて井戸を洗います。
コンカナリンA溶液を取り除いた直後に水を追加します。プレートを乾燥させないでください。ウェルのガラス表面からコンカナリンAを置き換えたり除去したりしないように、ピペットチップでプレートのコーティングされた底部に触れないようにすることが重要です。
コンカナリンA溶液と同じ方法で水を取り除き、すぐに顕微鏡プレートに185マイクロリットルの実験媒体を加えます。プレートを乾燥させておかないでください。プレートは、希釈された細胞の50マイクロリットルの追加の準備が整いました。
あなたの事前に成長したランダム化された96ウェルプレートを取り出します。実験の質問は、細胞が飽和しているか、対数相で、アッセイで使用されるべきランダム化された複製の数を決定します。ホイルカバーを取り外すときにクロスコンタミネーションの可能性を最小限に抑えるために、411倍Gで2分間プレートを遠心します。
あなたがそれを扱っているときにあなたの皿を傾けないようにしてください。酵母やメディアがプレートを覆うホイルに接触すると、井戸全体に汚染が発生する可能性があります。まず、あなたの連続希釈を行うプレートを準備します。
各希釈プレートに90マイクロリットルの実験用メディアを加えます。次に、セルを準備します。96ウェルプレートからホイルを取り外すときは、1つの井戸からの液滴が別の井戸に入るのを防ぐために非常に注意してください。
酵母は遠心分離のためにプレートの底部に濃縮されます。希釈中に細胞が十分に混合されるように、常に少量の細胞を大量のメディアに追加してください。次に、混合物に別の大量のメディアを追加します。
すべてのステップでピペットミックスを必ず激しく混ぜます。このビデオでは、飽和状態で酵母細胞の希釈を行い、合成完全な培地を10,000倍に希釈して、顕微鏡プレートのウェルあたり約4,000個の細胞の最終濃度を達成します。細胞を再中断するには、ピペットを激しく上下に動かし、ピペットチップを円運動でウェルの周りに動かします。
混合後、よくA1でここで見られるだけでなく、任意の井戸に残っている落ち着いた酵母の痕跡があってはならない。ここに示されている他のすべての井戸は、比較のために再中断されていません。例えば、前に成長したプレートの細胞を血球計で数え、同じウェルに同じ比率で追加する他の株と組み合わせます。ここでは、前に成長したプレートの細胞を蛍光基準株と1対1の比率で混合します。
細胞濃度が標準化されたら、10マイクロリットルの細胞を最初のシリアル希釈プレートに加えます。その後、200マイクロリットルの最終体積に100マイクロリットルの培地を加えます。細胞と培地を加えて、ピペットは激しく混ざり合い、ピペット先端を円運動でウェルの周りに移動させます。
この時点から、細胞が顕微鏡板に添加されるまで、プロトコルを迅速に進める。次に、第1のシリアル希釈板から2番目のシリアル希釈板に10マイクロリットルの酵母を加えます。その後、それに実験メディアの100マイクロリットルを追加します。
よく混ぜます。あなたの酵母が凝集する傾向がない場合、彼らはこのステップの直後に顕微鏡プレートに追加する準備ができています。すぐにめっきに進みます。
しかし、使用している酵母株が凝集する中程度の傾向を有する場合は、以下の任意超音波処理ステップが必要になります。超音波処理する場合は、最初のピペットは、超音波処理の前に、もう一度酵母溶液を混合します。希釈した酵母を超音波処理器に置き、96ウェルピンを各ウェルの溶液に沈めますが、井戸の底には触れないでください。
凝集酵母細胞を分解するのに十分強い超音波処理プログラムを設定しますが、細胞を殺したり、ストレス応答の上昇を引き起こしません。特定の実験に最適な超音波処理プログラムを特定するために、いくつかのテストが必要な場合があります。プログラムが完了したら、セルを削除し、すぐに次の手順に進みます。
2番目のシリアル希釈板から15マイクロリットルの酵母を顕微鏡プレートに加えます。ピペットはミックスするために上下に、しかしプレートの井戸の底に取り付けられたコンカナバリンAを邪魔しないように慎重に行います。次に、実験用培地200マイクロリットルを最終体積400マイクロリットルに加え、顕微鏡プレートに加えます。
ピペットは慎重に混ぜます。通気性のある膜でプレートを覆います。プレートのエッジが密閉されていることを確認します。
酵母細胞がプレートの底部のコンカナリンAに付着するために、その下に糸くずと静的自由な組織を持つ顕微鏡板を411倍Gで2分間遠心分離する。これで、プレートをイメージ化する準備ができました。顕微鏡では、プレートの上部と下部を糸くずと静的なフリーワイプで拭き取り、圧縮空気をプレートの底に吹き飛ばして破片を取り除きます。
プレートを顕微鏡の上に置きます。A1ウェルが左上隅にあり、顕微鏡が細胞成長のために正しい温度に加熱されていることを確認してください。また、プレートが顕微鏡にきちんと押し込まれ、プレートの底が平らであることを確認してください。
プレートにプラスチック製のカバーがある場合は、顕微鏡を開始する前にこれを取り外します。これは、ダウンストリーム解析に適した画像をキャプチャするために重要です。自動的に生成されたファイルをX座標とY座標と焦点位置にロードし、顕微鏡プレート全体を画像化します。
事前に生成されたファイルを使用する場合は、顕微鏡プレートのいくつかの位置をスポットチェックして、細胞が正しい焦点面にあることを確認します。焦点面が細胞の上にわずかに当てはまり、暗いリムに囲まれ、背景よりも明るくなるので便利です。実験に使用する時間ポイント数と時間間隔を設定します。
成長率と蛍光強度の両方のデータを収集する場合は、同様に蛍光イメージングプログラムを設定します。顕微鏡プレート上の位置が露出し過ぎないように、画像化するすべてのチャンネルの明るさを調整します。ライブ モードでないときに使用する露出をテストします。
蛍光画像の場合、蛍光は肉眼で見える必要があります。ただし、それ以外の場合は、低露出値を設定することをお勧めします。個々の細胞によって播種された適切に間隔を定めたコロニーは、プレートの表面に沿って単層に成長する。
その結果、自動画像解析を使用して、多くの個々のマイクロコロニーの成長率を正確に計算できます。蛍光マーカーは同じ井戸で成長する複数の株を区別するために使用することができる。その結果、共有環境で成長する個々のマイクロコロニーの成長率全体の分布を計算することができます。
この実験で達成可能な大きなサンプルサイズはまた異なった株または成長条件間の平均の相違の精密な推定を可能にする。ここで、一組の変異蓄積ラインとインウェルGFP基準対照コロニーから単一のウェルで成長したコロニーのペアセットの増殖率が示されている。細胞が顕微鏡板に凝集して観察される場合、凝集はめっき前に超音波処理によって分割されなければならない。
分割されていない塊の細胞は、プレート表面に沿って平面マイクロコロニーで成長せず、成長速度の正しい計算は不可能になります。すべての媒体がマイクロコロニー成長速度アッセイと互換性があるわけではありません。酵母エキスを含むメディアやpHが低いメディアを含む一部の形態のメディアは、細胞のコンカラナバリンAへの結合を防ぎます。
めっき細胞をあまりに密に避けることは重要です。細胞があまりにも密接にメッキされると、より速く成長するマイクロコロニーは、以前の時点でマージされ、ここでは色のトラッキングの損失として示されます。この効果は、成長の遅いコロニーが十分な時点からのデータが収集される前に隣人と合併する可能性が低いため、成長率の推定値をバイアスすることができます。
増殖条件に応じて、細胞のサブセットは成長を開始する前にラグフェーズを受ける可能性があります。すべての使用可能なタイム ポイントに成長曲線を適合させるのではなく、コロニー領域を使用して成長率を計算する場合は、この点を考慮することが重要です。記載されたプロトコルは、酵母の成長と進化に関連する幅広い質問を調査するために使用することができます。
その柔軟なマイクロプレート形式は、それが他の酵母種、異なる成長条件、他の微生物、および潜在的に培養中の他の細胞に適応することができることを意味します。
