NINDS助成NS49720とNS65819、およびNCIの助成金CA97257

1。腫瘍細胞調製。 人間の脳の腫瘍の異種移植用の細胞は、無胸腺マウスにおける皮下増殖として、または細胞培養から伝播腫瘍のいずれかから調達することができます。両方の細胞源の利用は、細胞移植のための方法のデモンストレーションとともに、以下に説明されています。 頭蓋内コンパートメントへの転送のために皮下腫瘍から細胞を調製するために、摘出した腹部の腫瘍は、組織が ​​最初にメスでみじん切りして、機械的に細胞の集合体のサスペンション1を作成するために反復的なピペッティングにより中断された培養皿、に配置されます。細胞の集合体懸濁液を頭蓋内注射に適した単一の細胞懸濁液を生成するフィルタ70μmナイロンメッシュを介して渡されます。細胞懸濁液を4℃、と（下記参照）最終的な作業の濃度を得るために無血清培地の適切な量で細胞ペレットを再懸濁する前に吸引された上清で10分間1000rpmで遠心分離される。頭蓋内注入のための確立された細胞株を調製するために、細胞は2の上方に示されるようにして細胞を遠心分離し、再懸濁させた、単層をトリプシン処理により、またはニューロスフェアの懸濁培養を収集して収穫されます。注入された細胞の数は、注射の神経解剖学的位置上の変数に依存しています。脳幹注射3、のために5 × 10 4個の細胞数は0.5μLに注入されるのに対し、テント上の注射のために我々は日常的に、無血清培地（DMEM）の3μLで3〜5 × 10 5細胞を注入する。推奨値よりも大きいボリュームを注入すると、結果の外方増殖性（図1）ではなく、頭蓋内腫瘍の成長と、針管を介して腫瘍細胞の逆流が発生する可能性があります。頭蓋内注射用サンプルを撤回した後、残りの細胞懸濁液を注射シリーズのメンバー間で頭蓋内腫瘍の設立を完了するまでの間に適切な濃度を維持するために頻繁に混合内容で、氷の中に配置する必要があります。 2。腫瘍細胞移植 （注）は、以下で説明するすべての手順は、カリフォルニア州サンフランシスコの大学で動物実験を使用し、ケア委員会が審査し、承認されている。 <ol><li>外科領域は、2％クロルヘキシジン液として、消毒剤で全表面を噴霧して準備する必要があります。消毒剤を使用した後、次の消耗品は、外科領域に配置してください。 <ul><li>マウスの体温を維持するために加熱パッド</li><li> 2％クロルヘキシジンを含む3％の過酸化水素を含むもの、一、二小シャーレ</li><li>滅菌ガーゼや綿棒</li><li>滅菌使い捨てメス</li><li>オートクレーブ滅菌外科用ステープラー</li></ul></li><li>麻酔のために注入された麻酔薬を使用する必要があります。典型的にケタミン - キシラジン混合物を。 </li><li>マウスの麻酔になると、頭皮がクロルヘキシジン溶液に浸した滅菌ガーゼで数回拭き取りによって調製される。眼軟膏は、手順の間に十分な水分を維持するために適用する必要があります。滅菌メスを使用して、長い約1cm、頭頂後頭骨上に矢状切開を行います。露出頭蓋骨の表面は、3％過酸化水素溶液に浸した綿棒を使用して洗浄される。ブレグマは（ビデオ参照）、この時点で明らかなはずである。 </li><li>腫瘍細胞の注入のための座標は、腫瘍の確立のための所望の部位に応じて異なります。以下は、我々は多くの脳腫瘍患者は腫瘍の発生が発生している時に神経解剖学的位置に脳内腫瘍の確立のための2を使用する手順を表します。脳腫瘍の研究に関心の他の場所は、脳幹腫瘍3の解剖学的モデリングのための橋、、および髄膜腫瘍の場所4をモデル化するための硬膜下注射などがあります。前の腫瘍細胞の注入に、それによって腫瘍細胞（ビデオ参照）を注入するための開口部を作成し、ブレグマと冠状縫合の前1mmの右から2 mmの穴を頭蓋骨に滅菌25ゲージ鋭い針を使用してください。この手順では、マウスとラット（ラット用22ゲージの針）の両方に適しています。 </li><li>シリンジにセルを描画する前に、指でタップすることにより細胞懸濁液の内容をミックス。空気の泡を作るように注意しながら、細胞懸濁液を所望の量で注射器をロードする。注射器の外側には、頭蓋外腫瘍の確立と成長（図1A）を防止する任意の接着細胞、の自由な外面を拭くためにアルコール綿で洗浄してください。適切な注入の深さが達成されることを確保するために、P20 pipettemanの先端の尖った端から3ミリメートルを切るメスを使用してください。先端のこのセクションでは、注射器を介して取り付けることができ、注入の深さを制限する働きをします、そしてさらにそのTIが保証されます注射針のpは、頭蓋骨の下側から3mmである。頭蓋骨にシリンジを垂直に置き、以前に作成した穴に、ゆっくりと細胞懸濁液（3μL懸濁液を1分間かけて注入する必要がある）を注入する。シリンジの挿入の不適切な角度は、細胞とそれに続く脊髄普及（図1B：右）の脳室内注入につながる可能性注入が完了すると、別の分のための場所に針を残し、その後徐々に（ビデオを参照）撤回：これらの手順が軽減されます腫瘍細胞の逆流。 </li><li>頭蓋内腫瘍細胞の移植5〜自力またはフリーハンドのアプローチに代わるものとして、一つは一般的に、より一貫性の注入の場所を促進する小動物の定位フレーム（回路図の概要のパネルF）、使用できますが、かなりの量を犠牲にし手続きの時間。フリーハンドのアプローチを使用するときに小動物の定位フレームを使用して最大注入率は約15匹のマウス/時間であるのに対し、我々の経験では、2つの手術スタッフは、できるだけ多く60などのマウス/時間を注入することができます。手続き上の便宜は、マウスの大規模なシリーズを注入する際に重要な考慮事項であり、そして注入されるように腫瘍細胞が、、氷の上に残されている時間を減らすのに役立ちます。 </li><li> 3％過酸化水素で頭蓋骨を洗浄し、滅菌綿棒を用いて乾燥させます。穴に無菌骨のワックスを適用します。鉗子を使用して、閉じて頭蓋骨と主食を介して一緒に頭皮を描く。最適な治癒のために、頭皮がお互いに対して頭皮の各側の真皮（底面に対して下面）でホチキス止めしてください。ステープル頭皮は、術後の疼痛緩和のための皮下注射により投与クロルヘキシジン液、およびブプレノルフィンを使用して清掃してください。 </li><li>彼らは歩行可能となり、正常な活性を保持するまで手術後にすべてのマウスを監視します。一般的に、回復時間は30分程度です。 </li></ol> 3。腫瘍増殖の生物発光のモニタリング<ol><li>背景。 [（ - ）-2 - （60 - ヒドロキシ- 20 -ベンゾチアゾリル）- thiazone -4 - カルボン酸D -]酸素とアデノシン三リン酸（ATP）の存在下で生物発光イメージング（BLI）は、ルシフェリンの酸化に基づいています。この反応は、光の結果放出で光子に化学エネルギーを変換する酵素のルシフェラーゼにより触媒される。人間の細胞はルシフェリン基質の存在下で光を発光することができる唯一の​​ルシフェラーゼ発現細胞と、（下記参照）ルシフェラーゼを発現するように変更することができます。腫瘍増殖およびin vivoでの治療に対する反応の高感度モニタリングを可能に、ルシフェラーゼで修飾された腫瘍細胞からの発光の排出量を検出するための非常に良好な信号対雑音比が存在するようにルシフェリンによる治療を受けたホストの動物からの最小限のバックグラウンド発光は、そこです。また、ルシフェラーゼおよびその基質、ルシフェリンは、哺乳動物細胞に対して毒性であることが示されている、と我々は対応する非修飾の細胞にルシフェラーゼの相対を発現する細胞間には機能の違いを認めていない。ルシフェリンは容易にそれによってルシフェラーゼで修飾された細胞を含むすべてのコンパートメントのイメージングを可能にする、細胞膜および腹腔内の後の血液脳関門（IP）またはマウスの静脈内（IV）注射を交差させる。ルシフェラーゼで修飾された細胞から放出される光のフォトン放出とスペクトルのレベルは、マウスやラットなどの小研究動物の組織に浸透するのに十分であり、低光イメージングカメラで外部から検出することができます。生物発光イメージングの非侵襲的な性質は、腫瘍の成長と個々の動物の被験者の治療への反応の繰り返しに監視できます。 </li><li>移植細胞源が安定してホタルルシフェラーゼ発現のために変更する必要があります。このような細胞源を購入、またはルシフェラーゼの構成的発現のために構築されたレンチウイルスを用いて個々の研究室で製造することができる。我々は強く繰り返している個々の動物の主題のための腫瘍負担の変化の正確な表示を提供するために、定量的な発光イメージングのために必要な生体内でルシフェラーゼの安定的な細胞の発現を確保するためにルシフェラーゼエンコーディングのレンチウイルスで修飾された細胞の使用ではなく、プラスミドを、、お勧め実験の過程で撮像。 </li><li> BLIの監視。我々は、腫瘍細胞の注射後の1週間を開始する、定量的な生物発光イメージング（qBLI）1X - 2X毎週を行うことをお勧めします。私たちのqBLIは、IVISルミナイメージングステーション（キャリパーライフサイエンス）を用いて実施し、我々の結果は、同様のデータがIVISルミナ、IVIS 150、またはIVIS 200イメージングステーションを使用して得られる示しています。イメージングのための準備として、マウスは注射後12分をイメージしたマウスで、腹腔内注射を介してケタミン/キシラジンおよび投与ルシフェリン（D -ルシフェリンカリウム塩、150 mg / kgを、キャリパーライフサイエンス）と同時に麻酔する。ルシフェリンの薬物動態はadminis間の時間を示しているルシフェリンと細胞の発光の測定の濃度は最大ルミネッセンス発光と検出の最高感度を得るために、ルシフェリンの10〜15分の注射後の間でなければなりません。 10-15分の時間間隔内で、選択した時間の長さは、撮像されている動物の中で定数として維持されるべきである。それは、BLIの測定値をルシフェリンと取得の注入の間の時間の長さに一貫性を維持することは非常に重要です。信号の頭蓋内領域を包含する関心領域リビングイメージのソフトウェア（図2）を使用して定義されており、合計photons/s/sr/cm2は（平方cmあたりステラジアンあたりの毎秒の光子）（ビデオを参照）に記録されます。 </li><li>データ解析。腫瘍の成長と治療応答を個々の動物で監視されているのに対し、我々は非常に抗腫瘍効果に関する結論の統計的な確実性を高めるために少なくとも8の治療群をお勧めします、または治療するために、その欠けている。 6,7を読んでそれに対応する最大の前処理の発光で、治療計画の完了に続いて提示qBLIの結果につきましては、発光の測定値は、各マウスの発光を割って正規化した値に変換され、中に得られたと。生存分析のために、カプラン-マイヤー推定量8が使用され、生存曲線が生成されているから、と生存期間の中央値の値が決まります。生存曲線の違いは、log - rank検定9を使用して比較されます。 </li><li>処理および未処理腫瘍のその後の分析のための脳の取得。動物の安楽死の際、マウスの脳は、すぐに（ビデオ参照）を摘出する必要があり、どちらかの腫瘍形態および免疫組織化学のその後の分析のためにホルマリンに入れ、または標本の凍結のために、OCTでマウントする必要があります。 </li></ol> 4。代表的な結果連続する平均発光値は、進行性の腫瘍の増殖が示されるまで、図3Aに示す例では、頭蓋内腫瘍細胞の注射を受けたマウスは、頭蓋内発光をモニターした、とする時間の治療は一日34の（灰色の矢印の先頭を開始されました：エルロチニブは150mgを毎日投与必要な安楽死になるまで/ kg）を。各マウスの発光値は、その最終的な前処理イメージング値に正規化した各マウスのその後の発光の測定値で、治療を開始する時に1の正規化された値に設定されています。例として、発光6.0に増加していた一日34で2.0 × 10 7光子/秒、最終的な前処理の発光の読書が付いているマウスは、毎日38℃× 10 7光子/秒が、一日38正規化された発光値を持つことになります3.0の。正規化された生物発光と制御と治療群の対応する標準誤差の平均は、それぞれの撮像時刻ポイントに対してプロットされています。本例では、平均値正規化発光の大きな違いは、その後の時点でさらに上昇を示し、平均群の発光の違いで、治療の開始（日38）に続いて最初の画像の時点で明らかです。ほとんどの場合、治療の抗腫瘍活性の、としてqBLIによって示される、、生存率に対応する有意差（すなわち、p &lt;0.05）が添付されているように、ここのケース（図3B）が。パネル3Cと3Dはセクショニングのホルマリンとその後のパラフィン包埋の切除脳の配置に続く、隣接ヘマトキシリン​​＆エオジンと安楽死の時に得られたマウスの脳の抗EGFR染色切片を示す。 <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。頭蓋内注入のエラー表示。 A）外方増殖性（頭蓋外）腫瘍の成長は（赤い丸）が大きすぎる注入量、シリンジに接続されている残留細胞懸濁液が原因で発生することができる、または腫瘍細胞を注入した後、速すぎると注射器を撤回。 B）脳室内に腫瘍細胞を注入することは、適切に注入された腫瘍細胞とは対照的に、注射部位（左のマウス）に局在化されたままとなる信号を腫瘍の脊髄播種（右マウス）を引き起こす可能性があります。 <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig2.jpg" alt="図2" /> 治療反応実験の図2。ヒートマップ画像の制御から代表的なマウスのための生物発光の強度の表現（左）と治療法（右）のグループ。リビングイメージソフトウェアが関心（赤丸）の領域を定義するために設定することができる、または機器のオペレータは手動での関心の領域を定義することができます。図の構築のためにこのような画像を使用するため、我々は、楽器の演算子は、動物の被験者の間で生物発光の違いの程度を視覚的に表現を提供するために、同一の生物発光のヒートマップの範囲（図の上部）を使用して、ヒートマップの画像が表示されることをお勧めします。 <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig3.jpg" alT =&quot;図3&quot;/&gt; 図3。生物発光、生存、および治療 ​​反応が明らかになっている実験から腫瘍組織の分析。 A）標準エラー出力を持つコントロールと治療群のマウスの平均生物発光の測定値のプロットは、それぞれ結像点のために示した。 B）同じマウスの生存プロット、p値はlog - rank検定7を使用して決定。腫瘍を持つマウスの脳のC）H＆E染色切片。 D）EGFR染色切片。腫瘍抑制タンパク質PTENのためのネガティブ染色を示すパネルEとEとF）はそれぞれのパネルCとDから指定された地域の倍率、、。

<ol>
	<li>Giannini, C., Sarkaria, J. N., Saito, A., Uhm, J. H., Galanis, E., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+Tumor+EGFR+and+PDGFRA+Gene+Amplifications+Retained+in+an+Invasive+Intracranial+Xenograft+Model+of+GBM.">Patient Tumor EGFR and PDGFRA Gene Amplifications Retained in an Invasive Intracranial Xenograft Model of GBM.</a> Neuro-Oncol. 7, 164-176 (2005).</li><li>Ozawa, T., Wang, J., Hu, L. J., Bollen, A. W., Lamborn, K. R., Deen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+human+glioblastomas+as+xenografts+in+the+brains+of+athymic+rats.">Growth of human glioblastomas as xenografts in the brains of athymic rats.</a> In Vivo. 1, 55-60 (2002).</li><li>Hashizume, R., Ozawa, T., Dinca, E. B., Banerjee, A., Prados, M. D., James, C. D., Gupta, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+brainstem+glioma+xenograft+model+enabled+for+bioluminescence+imaging.">A human brainstem glioma xenograft model enabled for bioluminescence imaging.</a> J Neurooncol. , (2009).</li><li>Baia, G. S., Dinca, E. B., Ozawa, T., Kimura, E. T., McDermott, M. W., James, C. D., VandenBerg, S. R., Lal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+skull+base+model+of+malignant+meningioma.">An orthotopic skull base model of malignant meningioma.</a> Brain Pathol. 2, 172-179 (2007).</li><li>Ozawa, T., James, C. D., Van Meir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Brain+Tumor+Cell+and+Tumor+Tissue+Transplantation+Models.">Human Brain Tumor Cell and Tumor Tissue Transplantation Models.</a> CNS Cancer: Models, Markers, Prognostic Factors, Targets, and Therapeutic Approaches. , 147-162 (2009).</li><li>Sarkaria, J. N., Yang, L., Grogan, P. T., Kitange, G. J., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., Galanis, E., Giannini, C., Wu, W., Dinca, E. B., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Molecular+Characteristics+Correlated+with+Glioblastoma+Sensitivity+to+EGFR+Kinase+Inhibition+Through+Use+of+an+Intracranial+Xenograft+Test+Panel.">Identification of Molecular Characteristics Correlated with Glioblastoma Sensitivity to EGFR Kinase Inhibition Through Use of an Intracranial Xenograft Test Panel.</a> Mol. Cancer Ther. 6, 1167-1174 (2007).</li><li>Dinca, E. B., Sarkaria, J. N., Schroeder, M. A., Carlson, B. L., Voicu, R., Gupta, N., Berger, M. S., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+Monitoring+of+Intracranial+Glioblastoma+Xenograft+Response+to+Primary+and+Salvage+Temozolomide+Therapy.">Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy.</a> J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).</li><li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-parametric+estimation+from+incomplete+observations.">Non-parametric estimation from incomplete observations.</a> J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).</li><li>Peto, R., Peto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymptotically+efficient+rank+invariant+procedures.">Asymptotically efficient rank invariant procedures.</a> J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185-207 (1972).</li><li>Camphausen, K., Purow, B., Sproull, M., Scott, T., Ozawa, T., Deen, D. F., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+in+vivo+growth+on+human+glioma+cell+line+gene+expression:+convergent+profiles+under+orthotopic+conditions.">Influence of in vivo growth on human glioma cell line gene expression: convergent profiles under orthotopic conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8287-8292 (2005).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

同所（頭蓋内）脳の腫瘍異種移植の確立は、治療反応のためにテストされるモデリングの中枢神経系の癌のための10適切な微小環境を提供します。モデリングのこのタイプは、さらに実験的なエージェントは、患者に臨床試験の評価に進出するかどうかを決定するために非常に重要であり、脳と脳の腫瘍への治療アクセスに関する情報を、提供します。頭蓋内異種移植腫瘍の量を直接測定することができないので、そのようなキャリパーなどによって、頭蓋内腫瘍の増殖と治療に対する反応の長手方向のモニタリングは、私たちの経験が主な目的の実験のための最も実用的なアプローチとして、生物発光イメージングを示すとともに、非侵襲的なイメージングが必要です治療に対する腫瘍の反応の程度を評価している。生物発光イメージングの結果は動物対象の生存分析と組み合わせると、2つのデータセットは実験的な治療効果を評価するための強力で信頼性の高いアプローチを提供しています。 最後に、それは頭蓋内の脳の腫瘍の異種移植が治療の形態学と分子の効果を評価するために安楽死させた動物の被験者から採取されることが非常に重要であり、このために我々は、その後の分析のために切除された脳の保全と、安楽死の時点で全脳の切除を好む。 前述のプレゼンテーションが脳腫瘍の研究に固有の行われているのに対し、概念は確かにげっ歯類における同所性モデリングに従順である他のヒト癌に一般化可能なです。

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposable Scapels</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2975</td>
			<td>No.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dunlap</td>
			<td>HP950</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22028563</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Chlorhexidine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9756995</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H312P-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25g Needle</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul Hamilton Sharp Microsyringe</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>20734</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin Stapler and Staples</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>59020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Frame</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Stoeling</td>
			<td>51725</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Caliper Life Science</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td>Potassium Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen Lumina</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Caliper Life Science</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging

ヒト脳腫瘍細胞を用いた移植モデルでは、長年にわたって神経腫瘍学の研究に不可欠な機能を提供している。過去には、ヒト腫瘍異種移植片を確立するための最も一般的に使用される手順は、免疫不全マウスで回収した細胞の皮下注射に続いて培養フラスコからの細胞の集まりで構成されていました。このアプローチは、まだ多くの研究室での頻繁な使用を見たのに対し、適切な神経解剖学的構造の中に腫瘍細胞の注入を必要とする、脳腫瘍のインスタンスで、同所性異種移植片の確立に向けた過去10年間重点に大きな変化を、そこにされている。頭蓋内移植の確立は、ノギスの利用、同所脳腫瘍異種移植モデルに向けた重点のシフトによる直接測定を介して腫瘍の成長、などを監視する機能がなくなるため、宿主動物における腫瘍の負担を評価するための非侵襲的イメージングの活用が必要になりました。現在利用可能なイメージングの方法のうち、生物発光のモニタリングは、一般的に感度、便宜、およびコストの最適な組み合わせを提供すると考えられている。ここでは、同所性脳腫瘍の確立のため、そして実験的な治療法をテストする際に腫瘍の増殖と治療に対する反応を監視するための手順をデモンストレーションを行います。

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Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

ルシフェラーゼで修飾された人間の脳の腫瘍異種移植片は、腫瘍の成長および生物発光イメージング法を用いて治療に対する反応のその後のモニタリングで、胸腺欠損マウスでは頭蓋内に確立することができます。生存時間解析と組み合わせることで、生物発光のモニタリングは、脳腫瘍の治療を検討している治療法の前臨床試験に不可欠な研究ツールです。

生物発光イメージングを使用して腫瘍の成長や治療に対する反応のその後の分析では頭蓋内脳の腫瘍異種移植片の確立

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most ...

establishing-intracranial-brain-tumor-xenografts-with-subsequent

Research

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Neuroscience

39.0K ビュー.  University of California, San Francisco - UCSF. ルシフェラーゼで修飾された人間の脳の腫瘍異種移植片は、腫瘍の成長および生物発光イメージング法を用いて治療に対する反応のその後のモニタリングで、胸腺欠損マウスでは頭蓋内に確立することができます。生存時間解析と組み合わせることで、生物発光のモニタリングは、脳腫瘍の治療を検討している治療法の前臨床試験に不可欠な研究ツール?...

ビデオ: Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional distractibility) effects (reviewed in 1). Complementing our recent protocol 2 describing a method that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion (see also 1, 3-5), here we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of the detrimental impact of emotion on cognition. The main feature of this method is that it allows identification of reciprocal modulations between activity in a ventral neural system, involved in 'hot' emotion processing (HotEmo system), and a dorsal system, involved in higher-level 'cold' cognitive/executive processing (ColdEx system), which are linked to cognitive performance and to individual variations in behavior (reviewed in 1). Since its initial introduction 6, this design has proven particularly versatile and influential in the elucidation of various aspects concerning the neural correlates of the detrimental impact of emotional distraction on cognition, with a focus on working memory (WM), and of coping with such distraction 7,11, in both healthy 8-11 and clinical participants 12-14.

We present a protocol that allows investigation of the neural mechanisms mediating the detrimental impact of emotion on cognition, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used with both healthy and clinical participants.

認知に関する情動の損なう効果の脳イメージング研究

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

神経科学

Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments in vision research require displays with more than 12 bits of luminance resolution. Several solutions are available. Bit++ 1 and DataPixx 2 use the Digital Visual Interface (DVI) output from graphics cards and high resolution (14 or 16-bit) digital-to-analog converters to drive analog display devices. The VideoSwitcher 3 described here combines analog video signals from the red and blue channels of graphics cards with different weights using a passive resister network 4 and an active circuit to deliver identical video signals to the three channels of color monitors. The method provides an inexpensive way to enable high-resolution monochromatic displays using conventional graphics cards and analog monitors. It can also provide trigger signals that can be used to mark stimulus onsets, making it easy to synchronize visual displays with physiological recordings or response time measurements.
Although computer keyboards and mice are frequently used in measuring response times (RT), the accuracy of these measurements is quite low. The RTbox is a specialized hardware and software solution for accurate RT measurements. Connected to the host computer through a USB connection, the driver of the RTbox is compatible with all conventional operating systems. It uses a microprocessor and high-resolution clock to record the identities and timing of button events, which are buffered until the host computer retrieves them. The recorded button events are not affected by potential timing uncertainties or biases associated with data transmission and processing in the host computer. The asynchronous storage greatly simplifies the design of user programs. Several methods are available to synchronize the clocks of the RTbox and the host computer. The RTbox can also receive external triggers and be used to measure RT with respect to external events. 
Both VideoSwitcher and RTbox are available for users to purchase. The relevant information and many demonstration programs can be found at <a href="http://lobes.usc.edu/">http://lobes.usc.edu/</a>.

Conventional computer hardware can not generate visual stimuli with sufficiently high grayscale resolution and measure response times with sufficient accuracy. We describe how to use the VideoSwitcher to produce high-resolution monochromatic displays, and the RTbox to measure response times with high accuracy on conventional computer hardware.

有効にする高解像度を表示し、従来のコンピュータ上で正確な応答時間の測定値をグレースケール

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in glioblastoma mutliforme (GBM), is to identify and isolate tumor initiating cell population(s) to investigate their role in tumor formation, progression, and recurrence. Understanding tumor initiating cell populations will provide clues to finding effective therapeutic approaches for these tumors. The neurosphere assay (NSA) due to its simplicity and reproducibility has been used as the method of choice for isolation and propagation of many of this tumor cells. This protocol demonstrates the neurosphere culture method to isolate and expand stem-like cells in surgically resected human GBM tumor tissue. The procedures include an initial chemical digestion and mechanical dissociation of tumor tissue, and subsequently plating the resulting single cell suspension in NSA culture. After 7-10 days, primary neurospheres of 150-200 &mu;m in diameter can be observed and are ready for further passaging and expansion.

This video protocol demonstrates the isolation and expansion of stem like cells from surgically resected human glioblastoma mutliforme (GBM) tumor tissue using the neurosphere assay culture method.

ニューロスフェアのアッセイを用いたヒト多形性膠芽腫の腫瘍細胞の単離と拡大

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when studying the brain, as the functional role that a brain area fulfills may be largely defined by its connections to other brain areas. In this report, we describe a novel, non-invasive approach for relating brain structure and function using magnetic resonance imaging (MRI). This approach, a combination of structural imaging of long-range fiber connections and functional imaging data, is illustrated in two distinct cognitive domains, visual attention and face perception. Structural imaging is performed with diffusion-weighted imaging (DWI) and fiber tractography, which track the diffusion of water molecules along white-matter fiber tracts in the brain (Figure 1). By visualizing these fiber tracts, we are able to investigate the long-range connective architecture of the brain. The results compare favorably with one of the most widely-used techniques in DWI, diffusion tensor imaging (DTI). DTI is unable to resolve complex configurations of fiber tracts, limiting its utility for constructing detailed, anatomically-informed models of brain function. In contrast, our analyses reproduce known neuroanatomy with precision and accuracy. This advantage is partly due to data acquisition procedures: while many DTI protocols measure diffusion in a small number of directions (e.g., 6 or 12), we employ a diffusion spectrum imaging (DSI)1, 2 protocol which assesses diffusion in 257 directions and at a range of magnetic gradient strengths. Moreover, DSI data allow us to use more sophisticated methods for reconstructing acquired data. In two experiments (visual attention and face perception), tractography reveals that co-active areas of the human brain are anatomically connected, supporting extant hypotheses that they form functional networks. DWI allows us to create a "circuit diagram" and reproduce it on an individual-subject basis, for the purpose of monitoring task-relevant brain activity in networks of interest.

We describe a novel approach for simultaneous analysis of brain function and structure using magnetic resonance imaging (MRI). We assess brain structure with high-resolution diffusion-weighted imaging and white-matter fiber tractography. Unlike standard structural MRI, these techniques allow us to directly relate anatomical connectivity to functional properties of brain networks.

fMRIと拡散強調画像を用いた脳の構造と機能の同時分析

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis and enable new strategies for in vitro modeling or repairing the diseased brain. Identifying brain-resident non-neuronal cell types amenable to direct conversion into iNs might allow for launching such an approach in situ, i.e. within the damaged brain tissue. Here we describe a protocol developed in the attempt of identifying cells derived from the adult human brain that fulfill this premise. This protocol involves: (1) the culturing of human cells from the cerebral cortex obtained from adult human brain biopsies; (2) the in vitro expansion (approximately requiring 2-4 weeks) and characterization of the culture by immunocytochemistry and flow cytometry; (3) the enrichment by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using anti-PDGF receptor-&#946; and anti-CD146 antibodies; (4) the retrovirus-mediated transduction with the neurogenic transcription factors sox2 and ascl1; (5) and finally the characterization of the resultant pericyte-derived induced neurons (PdiNs) by immunocytochemistry (14 days to 8 weeks following retroviral transduction). At this stage, iNs can be probed for their electrical properties by patch-clamp recording. This protocol provides a highly reproducible procedure for the in vitro lineage conversion of brain-resident pericytes into functional human iNs.

Targeting brain-resident cells for direct lineage-reprogramming offers new perspectives for brain repair. Here we describe a protocol of how to prepare cultures enriched for brain-resident pericytes from the adult human cerebral cortex and convert these into induced neurons by retrovirus-mediated expression of the transcription factors Sox2 and Ascl1.

誘導された神経細胞への成人の脳の周皮細胞由来細胞の系統の再プログラミング

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

細胞内のCaの蛍光と生物発光イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;高齢者における海馬ニューロン

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, formed by ribosomes, mRNAs, several proteins and non-coding RNAs, represent integrated platforms where translational controls take place. However, while the ribosome has been widely studied, the organization of polysomes is still lacking comprehensive understanding. Thus much effort is required in order to elucidate polysome organization and any novel mechanism of translational control that may be embedded. Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that allows the acquisition of 3D images at nanoscale resolution. Compared to electron microscopy (EM) techniques, one of the main advantages of AFM is that it can acquire thousands of images both in air and in solution, enabling the sample to be maintained under near physiological conditions without any need for staining and fixing procedures. Here, a detailed protocol for the accurate purification of polysomes from mouse brain and their deposition on mica substrates is described. This protocol enables polysome imaging in air and liquid with AFM and their reconstruction as three-dimensional objects. Complementary to cryo-electron microscopy (cryo-EM), the proposed method can be conveniently used for systematically analyzing polysomes and studying their organization.

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

原子間力顕微鏡で脳ポリソームでピアリング

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Kinematic Analysis Using 3D Motion Capture of Drinking Task in People With and Without Upper-extremity Impairments

Kinematic analysis is a powerful method for objective assessment of upper extremity movements in a three-dimensional (3D) space. Three-dimensional motion capture with an optoelectronic camera system is considered as golden standard for kinematic movement analysis and is increasingly used as outcome measure to evaluate the movement performance and quality after an injury or disease involving upper extremity movements. This article describes a standardized protocol for kinematic analysis of drinking task applied in individuals with upper extremity impairments after stroke. The drinking task incorporates reaching, grasping and lifting a cup from a table to take a drink, placing the cup back, and moving the hand back to the edge of the table. The sitting position is standardized to the individual&#39;s body size and the task is performed in a comfortable self-paced speed and compensatory movements are not constrained. The intention is to keep the task natural and close to a real-life situation to improve the ecological validity of the protocol. A 5-camera motion capture system is used to gather 3D coordinate positions from 9 retroreflective markers positioned on anatomical landmarks of the arm, trunk, and face. A simple single marker placement is used to ensure the feasibility of the protocol in clinical settings. Custom-made Matlab software provides automated and fast analyses of movement data. Temporal kinematics of movement time, velocity, peak velocity, time of peak velocity, and smoothness (number of movement units) along with spatial angular kinematics of shoulder and elbow joint as well as trunk movements are calculated. The drinking task is a valid assessment for individuals with moderate and mild upper extremity impairment. The construct, discriminative and concurrent validity along with responsiveness (sensitivity to change) of the kinematic variables obtained from the drinking task have been established.

This protocol describes an objective method to evaluate the movement performance and sensorimotor function of the upper extremity applied to individuals with stroke and healthy controls. A standardized test procedure, kinematic analysis and outcome variables for three-dimensional motion capture of drinking task are provided.

上肢障害の有無にかかわらず人に飲酒のタスクの 3 D モーションを用いた運動解析をキャプチャします。

Kinematic analysis is a powerful method for objective assessment of upper extremity movements in a three-dimensional (3D) space. Three-dimensional motion ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

神経活動と Spm と頭蓋内脳波データを使用した接続の分析

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...