我々は、彼らの専門的な支援のための博士アンドリューホランダー、サラ·デイビス、リー·シューマン、ティム·ジェンキンス、博士Xiangsheng Xuさんに感謝しています。私たちは、博士アンケネディのサポートを承諾。 BCBは、放射線生物トレーニンググラントC5T32CA009677でサポートされていました。 JFDは、医療科学者のためのバローズウェルカムキャリア賞（1006792）でサポートされていました。 JLBは、スーパークラスの助成金（5 R25 CA140116-03）でサポートされていました。我々は、その励ましと支援の研究が可能になる助けた博士スティーブ·ハーンを承認したいと思います。我々はまた、励ましや有益なコメントをペンシルベニアナノバイオインターフェースセンター（NBIC）博士とデニスディッシャー大学に感謝したいと思います。我々は彼らのMRIおよび生物発光/光中核施設の使用のためにペンシルベニア大学で小動物イメージング機能（SAIF）を認める。これらの技術は、米国立衛生研究所（RC1 CA145075とK08-NS076548によってサポートされていたプロジェクトの一環として開発された01）。

A.術前の腫瘍細胞の調製<ol><li>レンチウイルス発現ベクター（pGreenFireは、System Biosciences）で形質U251多形性膠芽腫細胞が安定的にホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現させた。 </li><li>これらの細胞は10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシン、およびでインキュベートT75組織培養フラスコ内の1％非必須アミノ酸を添加したDMEMで構成されていますイーグル培地（DMEM）、の完全ダルベッコ改変10mlの中で成長させた5％CO 2、37℃ </li><li>トリプシン処理し、続いて緩衝生理食塩水（PBS）、リン酸で細胞を洗浄から始まり、標準的な細胞培養を行う。 </li><li>完全DMEMでトリプシンをクエンチ、50ミリリットルの三角フラスコに溶液を移し、コールターカウンターを用いて細胞濃度を決定する。 </li><li>毎分約3000回転で3分間完全DMEMで採取された細胞を遠心分離します。 </li><li>遠心分離後の吸引50 mlコニカルフラスコの底部での細胞のペレットのみを残しウェブメディア。 </li><li> 50,000細胞/μlおよび氷上に置いた2ミリリットル滅菌バイアルへの転送、所望の濃度を達成するために、新鮮な完全DMEMのボリュームに再懸濁細胞は、乾燥から細胞を防ぐために迅速に取り組んでいます。 </li><li>細胞接着を防ぐために氷の上の細胞を簡単に毎〜20分、低設定にボルテックスして下さい。細胞は安全に氷上に配置した後2時間以内に頭蓋内の着床用に使用することができます。 </li></ol> B.同所性異種移植注入<ol><li>ベースライン、着床前の体重を確立するためにヌード胸腺欠損マウスNCR（のnu / nu）を計量する。私たちは通常、17〜24グラムの間の重みを持つマウスの年齢の6-10週を選択します。 </li><li>移植前に1時間、術後の痛みや炎症の治療薬として皮下注射を介して、非ステロイド性抗炎症薬メロキシカムの5 mg / kg投与でマウスをあらかじめ薬で治療。 </li><li> AnesthetizE 140 mg / kgを、それぞれ10 mg / kgの用量でケタミン/キシラジン混合物の腹腔内注射を持つ動物。 </li><li>マウスはつま先のピンチに対する動物の自発的応答を評価することによって、十分に麻酔をかけていることを確認します。動物がつま先のピンチに応答した場合は麻酔が効果を取るか、または追加の麻酔（元の金額の&lt;25％）を注入することを検討できるようになるまで、手順を遅らせる。 </li><li>マウスの頭が上にあることを確保しながら、鼻拘束のかまバーにマウスの切歯をフックと鼻の上にノーズクランプを締めることによってちょうどマウス定位プラットフォーム（Stoelting社）のStoeltingデジタルでの位置決めのために麻酔マウスを準備水平面。 </li><li>耳の棒の先端が外耳道の尾側にあるように、動物の位置を調整し、Stoelting定位プラットフォームに拘束されたマウスを転送します。動物の頭蓋から尾側の位置決めがadjusされたらテッドは、定位フレームにかまバーを固定します。マウスは、手術中にフィードバック制御温度調節を提供するStoeltingプラットフォームにテープで固定固いプラスチック加熱板（ハーバード装置）の上で休憩する必要があります。 </li><li>それらは、例えば、マウスの頭が水平面内にあり、指のタッチに固定化されたことを確保し、必要に応じて耳のバーの高さを調節する場合は、外耳道の尾部に耳バーを進める。耳バーを配置した後に呼吸困難の兆候がないかを注意深く監視している。緩めて、動物が苦痛になっている場合、再位置。 </li><li>動物の温度を監視するために、36の動物の体温を維持するために、マウスの下に配置された加熱板にフィードバック制御を提供するためにTCAT-2DF温度コントローラ（ハーバード装置）に接続されている直腸温度プローブ°中にCの潤滑先端を挿入手順。 </li><li> preveする目に眼軟膏を適用ntは乾燥。 </li><li>目を避けるように注意しながら、切開部位を消毒するために、マウスの頭の上にベタジンソリューションを適用します。 </li><li>マウスを確認するためにつま先のピンチを実行し、必要に応じて追加のケタミン/キシラジン（初期投与量の&lt;25％）の少量を提供する、無意識です。 </li><li> 0.45ミリメートルバリドリルビット（Stoelting）アルコールパッドを使用してドリル（Foredomマイクロドリル）に取り付けられており、その後にのみドリルビットを浸漬し、15秒間ガラスビーズ滅菌器（オーチャードグラス500、CellPointサイエンティフィック）のドリルビットを殺菌を清掃殺菌ビーズ。 </li><li>滅菌メスを使用して、尾目の高さから延び半ば頭皮に縦0.75センチメートルの切開を行う。ブレグマの可視化を確認してください。 </li><li> Stoeltingプラットフォームにドリルホルダを取り付け、所定の位置に固定して、ドリルホルダで0.45ミリメートルバリドリルビット（Stoelting）とドリル（Foredomマイクロドリル）を置きます。 </li><li>まさにトン以上のドリルビットを配置彼はその後ブレグマとゼロアウトのx、y、zは、デジタル定位ディスプレイの座標。骨のみを刺し、位置後方2ミリメートルとForedomドリルで動物の頭蓋骨に右大脳半球とドリルでブレグマ横1.5mmにドリルの先端に移動します。滅菌綿棒を穏やかに頭蓋骨の可視化を容易にするために切開の縁を後退させるために使用することができます。 </li><li>定位プラットフォームからドリルとドリルホルダーを取り外します。 </li><li>定位プラットフォームにNanomiteインジェクタシリンジポンプ（ハーバード装置）を取り付けます。 </li><li>氷から細胞を取り出して、そっと短いパルスを用いて腫瘍細胞を含むバイアルまたは細胞を再懸濁するためにバイアルをフリックどちら優しく渦。 10μLシリンジ（ハミルトンシリンジ）に取り付けられた30ゲージ1 &quot;長いフラットベベル針を介して細胞懸濁液7μlを策定する。シリンジ内の大きな気泡を避けてください。流体の初期6μl中に気泡がないことを確認WHICHは、マウスに注入総量になります。残りの1μlで小さな気泡がない問題になっています。細胞へのダメージを最小限に抑えることが可能であれば、細胞懸濁液の描くアップを繰り返さないようにしてください。 </li><li>シリンジ注入器に充填した注射器を置きます。アルコールパッドを使用して、頭蓋外の空間に増殖する腫瘍になることがあり、癌細胞で切開部位の汚染を防止するために、針の先端に現れる細胞懸濁液のいずれかを削除してください。 </li><li> 0.5μL/分の速度で6.0μLを提供するために、噴射ポンプを設定します。注入後、シリンジ内に残っている細胞懸濁液1μlのは、頻繁に注射器で収集気泡が動物に注入されていないことを保証します。気泡の注入は、致命的な空気塞栓につながる可能性があります。 </li><li>頭蓋骨に針を垂直（90度）を維持バリ穴に注射針を進める。針は、頭蓋骨、coordin出ゼロを横断した後次に定位デジタルディスプレイ上のATES、それは2.5mmの深さに達するまでゆっくりと4分間かけて針の先端を進める。針は後部海馬の皮質と部分を通過する。のx、y、zは定位注入の座標は、視床と、腫瘍細胞と脳脊髄液を播種の可能性を低減心室への近接などの重要な脳の構造への損傷を回避しながら、大脳半球内に横方向に配置され、腫瘍を発生させるために選ばれました望ましくない脊髄腫瘍を生じさせる可能性がある。ブレグマに対する相対位置が後方の軌道に大きな潰瘍、局所進行性腫瘍の可能性を低減するために選択した。 2分間の深さに針で一時停止した後の細胞の注入を開始します。 </li><li>注入中に、中にバリ穴から還流した可能性のある腫瘍含有流体を除去するために顕微スポンジ槍で繰り返し頭蓋骨を乾かす注入。顕微スポンジで針を中断することは避けてください。この流体を削除すると、頭蓋外の空間に成長する腫瘍の可能性を減少させる必要があります。 </li><li>注入が完了した後、約2分間の脳に針を残して、その後徐々に3から4分間にわたって針を撤回します。 </li><li>耳バーや鼻拘束を緩め、定位装置からマウスを削除します。 </li><li>滅菌綿棒の木製の端から削り穴を行き来ワックスをこすりによって堆積無菌骨ワックスで頭蓋骨の穿頭孔を閉じます。穴が完全に密封され、バリ孔を封止する骨ワックスが隣接頭蓋骨と一直線になっているかまで、骨蝋適用を続行します。 </li><li>再おおよその滅菌綿棒と切開部の縁や動物の目に接着剤の曝露を避けるように注意しながら、傷口を密閉するために獣医組織接着剤を適用します。 </li><li>最後に、37に設定した加熱パッドの上にマウスを置き°動物まで、Cは意識を回復します。マウスは、アラートと応答されると、元のケージに戻し動物を転送します。 </li></ol> C.生物発光イメージング（BLI）は、腫瘍の成長や治療への反応を監視する簡単な指示には生物発光イメージングのために従ってください。 <ol><li>以前に2パーセントイソフルランと酸素室で腫瘍を移植したマウスを麻酔。 </li><li>マウスは麻酔ですが、50 mg / mlの濃度になるようにPBSで希釈したD-ルシフェリンカリウム塩の60μlを皮下または腹腔内にそれらを注入。 </li><li>生物発光イメージングスキャナのノーズコーンに麻酔の流れをオンにして、素早くノーズコーンで自分snoutsを置くスキャナにマウスを移す。 </li><li>はるかに低い信号と隣接する腫瘍に高信号強度と腫瘍からの生物発光信号の出血を制限するために、マウスの間で黒い仕切りを置きます。 </li><li>使い方リビングImageソフトウェア、D-ルシフェリンの注射の時間の30分後までの合計期間に頻繁にシリアルエクスポージャーを取る。我々は、下または露出オーバーの画像の可能性を制限する &quot;オート&quot;に露光時間を設定好む。単一の露出が&gt; 5分であってはならない。 </li><li>適当な間隔で生物発光イメージングを繰り返し実行します。シリアル毎週イメージングは​​、治療への反応をテストし、多くの縦の実験のための合理的なオプションです。 </li><li>画像の取得後は、生物発光イメージングセッション中に取得した各画像における各腫瘍の周りに関心領域（ROI）の領域を描画することによって腫瘍を分析するために生きているイメージのソフトウェアプログラムを使用します。背景生物発光信号強度の度合いに基づいて腫瘍の生物発光信号を補正するための関心の背景領域として各画像の各マウスの下側側面に、第2の目的は、小さい領域を適用します。私たちは、 &quot;ラディアンス&quot;の設定ではなく出力として &quot;カウント&quot;を使用して好む生物発光信号の値。 </li><li> ExcelにROIの結果をエクスポートし、各マウスの最大バックグラウンドで調整生物発光信号を決定します。 </li><li>腫瘍増殖のシリアルモニタリングに示されるように、生物発光イメージングを繰り返します。私たちの実験では、毎週のBLIを実行します。 D-ルシフェリンの注射後30分 - 我々は5の上に頻繁なエクスポージャーを取るこ​​とにより、指定されたイメージングセッションに対する最大のBLI信号を決定することを好む。 </li></ol> D.描写結果この定位注入法は、90〜100％の成功腫瘍テイク率は、5％より通常小さい低周術期死亡率と関連しています。意図しない副作用の危険性は、腫瘍細胞または穿頭孔の不十分な閉鎖が付いている切開のいずれかの播種から心室、または頭蓋外腫瘍の成長に移植した腫瘍細胞から脊髄の播種などの合併症を含めて、また、この手法の低いA頭蓋骨の開口部を通って拡大して頭蓋内腫瘍をllowing。 腫瘍異種移植片の ex vivo での解析では、低酸素状態の予想領域を実証VEGFの発現、および壊死の増加となりました。安定的に私たちのGBM細胞株によって発現緑色蛍光タンパク質（GFP）の蛍光顕微鏡では、これらの異種移植片の浸潤性質を明らかにした。 図1は、マウスの脳へのGBM細胞の典型的な成功した定位注入の結果を示しています。これは21日ここで説明されたテクニックを持つ、移植後9.4テスラの磁石を用いて行ったマウスの脳のT2強調脳MRIスキャンであり、 図1は、19ミリメートル3を測定する右半球（ピンクで輪郭）で腫瘍の単焦点を明らかにするそれは移植部位の正確な座標に局在する。 図2は technを使用して生物発光イメージングの結果を示してい<html> iquesか全脳照射（4Gyの×4毎日の画分）または全く治療を受けることが最大の生物発光信号強度に基づいて均等に層別化された定位的に移植された腫瘍で、10匹のマウスのグループのためにここで説明。この実験では、生物発光イメージングは​​、信号が実質的に癌細胞の未チェックの増殖による模擬照射対照腫瘍で増加する一方、放射線療法は、検出された生物発光シグナルの増加なしで、その結果、移植された腫瘍の増殖を阻害することを示しています。 図1（ビデオ）。腫瘍体積（ピンク色）の輪郭とU251多形性膠芽腫の腫瘍を含むマウス脳の冠状MRIのセクションを参照してください。スキャンが9.4テスラスキャナの上にスピンエコーT2強調プロトコルを使用して行われた。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4089/4089movie1.m4v" target="_blank">ムービーを見るにはここをクリック</a> 。 RE 2は &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4089/4089fig2.jpg &quot;/&gt; 図2：定位的に注入された多形性膠芽腫の腫瘍を持つ10匹のマウスは、外部照射4分画に16 Gyの治療または無治療のいずれかで処理した。マウスは、治療開始後、治療前に、毎週の生物発光イメージングで描出された。グラフには、倍の変化が治療前の最大のBLI値を現在最大のBLI値の比として定義される中央値倍数変化として計算された相対生物発光を提示します。

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	<li>Stupp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).</li><li>Jacobs, V. L., Valdes, P. A., Hickey, W. F., De Leo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+review+of+in+vivo+GBM+rodent+models:+emphasis+on+the+CNS-1+tumour+model.">Current review of in vivo GBM rodent models: emphasis on the CNS-1 tumour model.</a> ASN Neuro. 3, e00063 (2011).</li><li>Shelton, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pre-clinical+in+vivo+mouse+model+for+malignant+brain+tumor+growth+and+invasion.">A novel pre-clinical in vivo mouse model for malignant brain tumor growth and invasion.</a> J. Neurooncol. 99, 165-176 (2010).</li><li>Brehar, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+xenograft+glioblastoma+implants+in+nude+mice+brain.">The development of xenograft glioblastoma implants in nude mice brain.</a> J. Med. Life. 1, 275-286 (2008).</li><li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging.">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).</li><li>Radaelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistopathological+and+neuroimaging+characterization+of+murine+orthotopic+xenograft+models+of+glioblastoma+multiforme+recapitulating+the+most+salient+features+of+human+disease.">Immunohistopathological and neuroimaging characterization of murine orthotopic xenograft models of glioblastoma multiforme recapitulating the most salient features of human disease.</a> Histol. Histopathol. 24, 879-891 (2009).</li><li>Baumann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+efficacy+of+drug-loaded+nanocarriers+against+brain+tumors+by+targeted+radiation+therapy.">Enhancing the efficacy of drug-loaded nanocarriers against brain tumors by targeted radiation therapy.</a> , (2012).</li><li>Baumann, B. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+monitoring+of+intracranial+glioblastoma+xenograft:+response+to+primary+and+salvage+temozolomide+therapy.">Bioluminescence monitoring of intracranial glioblastoma xenograft: response to primary and salvage temozolomide therapy.</a> J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

本稿で述べたマウスでは、がん細胞の定位注入の方法が合理的に再現可能な臨床神経膠芽腫膠2、6-8の浸潤および急速な成長パターンを再現腫瘍を発生させる。この手法は、特に匹敵する大きさと生物学的特性および特定の解剖学的位置で再現腫瘍が望まれている別の治療群に均等にマウスを階層化実験に適しています。私たちが説明する技術を用いて、腫瘍細胞の定位的注入はほと?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 説明 </td><td> サプライヤー </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>単にマウス定位固定装置のためのデジタル</td><td> Stoelting </td><td> 51730D </td><td>マウス移植のための定位プラットフォーム</td></tr><tr><td>ケタミン/キシラジン</td><td></td><td></td><td>注射麻酔</td></tr><tr><td> Puralube獣医軟膏（眼科） </td><td> Amazon.com </td><td></td><td>マウスの目の乾燥を防ぐために</td></tr><tr><td>定位プラットフォーム用のホルダーをあける</td><td> Stoelting </td><td> 51681 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロモーター電気ドリル</td><td> Stoelting </td><td> 51449 </td><td>頭蓋骨をあけるための</td></tr><tr><td> 0.45ミリメートル超硬ドリルビット</td><td> Stoelting </td><td> 514551 </td><td></td></tr><tr><td>滅菌綿棒</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 23-400-100 </td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーズ乾燥滅菌器（オーチャードグラス500） </td><td>トリーサイエン</td><td> GER-5287 </td><td>金属手術器具を滅菌するために</td></tr><tr><td>マウス直腸プローブ</td><td>トリーサイエン</td><td> RET-3-ISO </td><td>温度コントローラと互換性が</td></tr><tr><td>温度コントローラ（TCAT-2DF） </td><td>ハーバード装置</td><td> 727561 </td><td>手術中の動物の体温を維持するための温度コントローラ</td></tr><tr><td>小さな加熱板</td><td>ハーバード装置</td><td> 727617 </td><td>手術中にマウスを暖める温度コントローラーで使用するため。加熱板は、定位のプラットフォーム上でマウスの下に収まります。 </td></tr><tr><td>使い捨て外科用メス</td><td> BDバード - パーカー</td><td> 2015から11 </td><td>第10位メス</td></tr><tr><td> 10マイクロリットルのシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td> 7635から01 </td><td>腫瘍細胞を注入するための</td></tr><tr><td>フラットポイントとの長い30ゲージ針、1 &quot;、 </td><td>ハミルトン</td><td>さまざまな</td><td> 10μlの注射器と互換性がなければなりませ</td></tr><tr><td>プログラマブルシリンジポンプをNanomite </td><td>ハーバード装置</td><td> 704507 </td><td>定位固定装置用のデジタルモーターシリンジインジェクター</td></tr><tr><td>セルロース無菌手術槍スポンジ</td><td> Ultracell </td><td> 40410 </td><td>手術野を乾燥させる</td></tr><tr><td>骨ろう</td><td>エチコン</td><td> W31 </td><td>穿頭孔を封止する</td></tr><tr><td> Tissumend IIの合成吸収性組織接着剤</td><td>獣医製品研究所</td><td> 3002931 </td><td>切開を封止する</td></tr><tr><td>温暖化パッド付き温水ポンプ</td><td> GaymaR </td><td> TP-650 </td><td>術後の期間に温まるマウス</td></tr><tr><td> IVISルミナII </td><td>キャリパーライフサイエンス</td><td></td><td>生物発光イメージャー</td></tr><tr><td> D-ルシフェリンカリウム塩</td><td>ゴールドバイオテクノロジー</td><td> LUCK-1 </td><td>生物発光イメージングのためのルシフェリン</td></tr></tbody></table>

stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme

多形性膠芽腫（GBM）は外科的切除、術後放射線療法とテモゾロミド療法1から構成される標準のトライ集学的治療にもかかわらず、ヒトでのみ14.6ヶ月の生存期間の中央値を持つハイグレード原発性脳腫瘍である。新しい治療法は明らかに生活の患者の生存率と品質を向上させるために必要とされる。より効果的な治療戦略の開発は、人間の病気を再現まだ腫瘍の成長や治療に対する反応を監視するためにシリアルイメージングを可能GBMの動物モデルによって支援されるであろう。本稿では、GBMの2のキーの臨床的特徴を再現腫瘍異種移植片を生じるヌードマウスの脳にバイオイメージング可能GBMの癌細胞の正確な定位注入のための私たちのテクニックを説明します。この方法では、再現性がある腫瘍をもたらし、順次内を監視するために生体内生物発光イメージングを可能にしながら、正確な解剖学的位置に配置されてい頭蓋の異種移植片の成長と治療3-5から応答。また、この方法は、低周術期の罹患率と死亡率を持つ動物での忍容性は良好である。

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Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

私たちは、ヌードマウスとその後シリアルの脳に人間の多形性膠芽腫細胞の正確な、定位注入のための統合方法を説​​明<em生体内で&gt;</em&gt;イメージングは​​成長し、得られた異種移植片の治療に対する反応を監視することができます。

定位頭蓋内注入と<emインビボ&gt;</em多形性膠芽腫のマウスモデル系における腫瘍異種移植片の&gt;生物発光イメージング

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

stereotactic-intracranial-implantation-vivo-bioluminescent-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

25.5K ビュー.  University of Pennsylvania. 私たちは、ヌードマウスとその後シリアルの脳に人間の多形性膠芽腫細胞の正確な、定位注入のための統合方法を説​​明イメージングは​​成長し、得られた異種移植片の治療に対する反応を監視することができます。

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Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

医学

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

マウスモデルにおける乳がんの脳転移の腫瘍の低酸素動態の in vivo生物発光イメージングに

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate since the advent of in vivo bioluminescent imaging technologies 1-3. Indeed, the ability to locate and quantify tumor growth longitudinally in a single cohort of animals to completion of the study as opposed to sacrificing individual groups of animals at specific assay times has revolutionized how researchers investigate breast cancer metastasis. Unfortunately, current methodologies preclude the real-time assessment of critical changes that transpire in cell signaling systems as breast cancer cells (i) evolve within primary tumors, (ii) disseminate throughout the body, and (iii) reinitiate proliferative programs at sites of a metastatic lesion. However, recent advancements in bioluminescent imaging now make it possible to simultaneously quantify specific spatiotemporal changes in gene expression as a function of tumor development and metastatic progression via the use of dual substrate luminescence reactions. To do so, researchers take advantage for two light-producing luciferase enzymes isolated from the firefly (Photinus pyralis) and sea pansy (Renilla reniformis), both of which react to mutually exclusive substrates that previously facilitated their wide-spread use in in vitro cell-based reporter gene assays 4. Here we demonstrate the in vivo utility of these two enzymes such that one luminescence reaction specifically marks the size and location of a developing tumor, while the second luminescent reaction serves as a means to visualize the activation status of specific signaling systems during distinct stages of tumor and metastasis development. Thus, the objectives of this study are two-fold. First, we will describe the steps necessary to construct dual bioluminescent reporter cell lines, as well as those needed to facilitate their use in visualizing the spatiotemporal regulation of gene expression during specific steps of the metastatic cascade. Using the 4T1 model of breast cancer metastasis, we show that the in vivo activity of a synthetic Smad Binding Element (SBE) promoter was decreased dramatically in pulmonary metastasis as compared to that measured in the primary tumor 4-6. Recently, breast cancer metastasis was shown to be regulated by changes within the primary tumor microenvironment and reactive stroma, including those occurring in fibroblasts and infiltrating immune cells 7-9. Thus, our second objective will be to demonstrate the utility of dual bioluminescent techniques in monitoring the growth and localization of two unique cell populations harbored within a single animal during breast cancer growth and metastasis.

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Herein we describe the methods to construct, visualize, and quantify the bioluminescent reactions of both firefly and renilla luciferase enzymes expressed in metastatic breast cancer cells during their growth and metastasis in vivo.

生体デュアル基質生物発光イメージングにおける

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

その後の3Dと頭蓋内注入インビボでの</emマウス神経膠腫の>生物発光イメージング

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

ゼブラ土着腫瘍モデルを用いたメラノーマの修飾のためのスクリーニング

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

乳癌のマウスモデルにおいて腫瘍微小環境における薬剤応答のイメージングを生きる

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

新規高分解能<em生体内で&gt;</em腫瘍増殖と治療に頭蓋内構造物の動的応答を研究する&gt;イメージング技術

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

細胞追跡のためのin vivoでの19 F MRI における

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

マウス収縮圧力を測定するために子宮内テレメトリ<em&gt;インビボ</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

皮下腫瘍モデルにおける腫瘍浸潤白血球サブセットの評価

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

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定位頭蓋内注入と