まず、培養したiPS細胞をダルベッコのPBSまたはDPBSで洗浄します。そして1ミリリットルのタンパク質分解性およびコラーゲン分解性混合物を加える。皿を摂氏37度で2分間インキュベートして細胞を剥離します。
次に、予熱したiPS細胞培養液1.5ミリリットルを加えて反応を停止させます。細胞培養皿から細胞を7〜10回上下にピペッティングして解離し、単一細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐形遠心管に移します。
細胞を室温で5分間200xgでペレット化します。上清を吸引する。ペレットを50マイクロモルのY27632を添加した2ミリリットルのiPS細胞培地に再懸濁します。
次に、10マイクロリットルの細胞懸濁液を使用して、ノイバウアーチャンバーを使用して細胞をカウントします。50マイクロモルのY27632を添加したiPS細胞培養液を用いて、細胞懸濁液の濃度を150マイクロリットル当たり9, 000細胞に調整する。胚様体またはEBを生成するには、細胞懸濁液チューブを振って細胞沈降を防ぎ、150マイクロリットルの細胞懸濁液を超低接着96ウェルプレートの各ウェルに播種します。
EBを加湿雰囲気中で48時間培養します。インキュベーションの終わりに、ウェルあたり100マイクロリットルの培地を除去します。そして、Y27632なしで150マイクロリットルの予熱された新鮮な培地を追加します。
パラフィルムグリッドを0.2ミリリットルのチューブラックに配置し、紙で包まれた面を上に向けて、パラフィルムに4x4のディンプルグリッドを作成します。そして、手袋をはめた指を各ラックの穴にそっと押し付けて、EBを基底膜マトリックスに埋め込みます。次に、紙を取り除き、はさみを使用してパラフィルムの正方形からディンプルグリッドを切り取り、60ミリリットルの細胞培養皿に収まるようにサイズを調整します。
ディンプルパラフィルムを0.2ミリリットルのチューブラックに戻し、基底膜マトリックス液滴生成の基礎を提供します。培養皿のウェルからパラフィルムディンプルに、200マイクロリットルのピペットチップをカットしたピペットを使用して、EBを次々に慎重に移します。16 EBをグリッドに移動した後、新しい200マイクロリットルのピペットチップを取り、残りの培地をディンプルから取り出します。
次に、1滴の基底膜マトリックスを1つのEBを含む各ディンプルにピペットで移します。10マイクロリットルのピペットチップを取り、液滴の境界を乱すことなく、EBを各液滴の中心にすばやく移動します。ディンプルパラフィルムを基底膜マトリックスドロップとともに60mmの細胞培養皿に入れます。そして、マトリックスを重合させるために摂氏37度で15〜30分間インキュベートします。
さらに、マトリックス包埋EBをパラフィルムから剥離するために、ビタミンAを含まない5ミリリットルの分化培地を皿に加える。そして、EBのある側が皿の底を向くように、鉗子を使用してパラフィルムの正方形を逆さまにします。皿を注意深く振って、EBを含む基底膜マトリックス液滴をパラフィルムから切り離します。
それらのいくつかがまだ取り付けられている場合は、鉗子を使用してパラフィルムの正方形の端を取り、皿の中央に向かって何度もすばやく巻き上げます。次に、脳オルガノイドをオービタルシェーカー上で55rpm、5%二酸化炭素および95%空気を含む加湿雰囲気中で摂氏37度で培養します。オルガノイドをビタミンAを含まないDMに保管し、1日おきに培地を交換します。
播種後32日目のヒト脳オルガノイドの明視野画像は、末梢に心室様構造を有し、コンパクトで健康な形態を有する。
