コントロールおよび目的の遺伝子のために十分な量のエレクトロポレーションミックスを調製することから始める。ペトリ皿電極チャンバーをエレクトロポレーターに接続します。次に、マイクロローダーチップを使用して、マイクロインジェクションニードルに各エレクトロポレーションミックス8マイクロリットルを充填します。
使用前に針の先端を切って、細かいハサミで安定した流れを実現します。先端が鈍くて幅の広いとオルガノイドに深刻な損傷を与える可能性があるため、先端のごく一部だけを取り除いてください。顕微鏡下で、滑らかな境界と目に見える心室様構造を持つ5つの大脳オルガノイドを選択します。
次に、カットした1000マイクロリットルのピペットチップを使用して、予熱したDMEM/F-12を含む35mmの細胞培養皿に移します。次に、心室のような構造の壁に針を注意深く挿入し、目に見えるまでエレクトロポレーションミックスを注入します。破裂を避けるために、心室のような構造に過度の圧力をかけないでください。
微量注入した脳オルガノイド1個を少量のDMEM/F-12とともにシャーレ電極室に移します。マイクロ注入された心室様構造体の表面がエレクトロポレーターの正極に接続された電極の方を向くようにオルガノイドを配置します。次に、80ボルトの5つのパルスを使用して、それぞれ50ミリ秒間、1秒の間隔で脳オルガノイドを1つずつ電気分解します。
マイクロインジェクションとエレクトロポレーションを非滅菌条件下で行った場合は、層流フードの下でエレクトロポレーションしたオルガノイドを、予熱したDMEM/F-12で満たされた新しい35mm細胞培養皿に移動します。次に、エレクトロポレーションオルガノイドをDM中でビタミンAとともにオービタルシェーカー上で55 RPMで、5%二酸化炭素および95%空気の加湿雰囲気中、摂氏37度で培養します。翌日、エレクトロポレーション後、従来の倒立蛍光顕微鏡で脳オルガノイドのエレクトロポレーションが成功するかどうかを確認します。
カットした1000マイクロリットルのピペットチップを使用して、エレクトロポレーションオルガノイドを15ミリリットルの円錐形遠沈管に移し、余分な培地を除去します。DPBSに十分な量の4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で30分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、パラホルムアルデヒドを吸引します。
次に、5ミリリットルのDPBSを追加し、軽く振って、DPBSを吸引します。オルガノイドは、さらに使用するまで摂氏4度のDPBSに保管してください。エレクトロポレーションの2日後、GFP陽性細胞はほぼ独占的に心室帯に局在し、Pax6陽性であり、これらの細胞が頂端前駆細胞または新生児基底前駆細胞であることを示しています。
10日後、GFP陽性細胞は基底領域に局在する。これらの細胞は、それぞれ基底前駆細胞またはニューロンを示すPax6またはNeuNに対しても陽性です。GFP陽性細胞の3−D分布の印象を得るためのエレクトロポレーション大脳オルガノイドの3−D再構成が示されている。
