High-Pressure Freezing (HPF), Freeze-Substitution Fixation (FSF) and Rehydration of Sapphire Disc-Carrier Assembly

製造元の指示に従って、実験を開始する少なくとも2時間前に、高圧凍結機またはHPF機を準備します。タイプA HPFアルミニウムキャリアを1ミリリットルのエタノールを含む2ミリメートルの遠沈管に移し、超音波洗浄機で10分間超音波処理します。定性的なろ紙で覆われたペトリ皿でキャリアを乾燥させます。

洗浄済みの担体を1-ヘキサデセンに浸します。細いピンセットを使用して、HeLa細胞培養皿から事前に準備されたサファイアディスクをピックアップします。ラベル面を定性濾紙で触れて、余分な培地を取り除きます。

サファイアディスクをHPF試料ホルダーに取り付け、1-ヘキサデセンを含む深さ0.025ミリメートルのアルミニウムキャリアでディスクをすばやくキャップします。定性的なろ紙で余分な溶液を吸引します。高圧凍結用の試料ホルダーをロードします。

サファイアディスクキャリアアセンブリを液体窒素下でフォームクライオボックスにアンロードします。凍結置換固定またはFSF溶液を2ミリリットル、ヒュームフード内の20mm円形ポリプロピレン容器に1つずつ準備し、液体窒素を使用して凍結します。予冷したピンセットを使用して、サファイアディスクとキャリアアセンブリを液体窒素下で凍結したFSF溶液1の入った容器に入れます。

この容器を予冷された自動凍結置換機チャンバーに移し、摂氏マイナス90度でFSF処理を行います。試験片を摂氏マイナス90度で1時間保持してから、予冷したピンセットでサファイアディスクをキャリアから分離し、サファイアディスクのマークされた側面が下を向いていることを確認します。試験片をさらに摂氏マイナス90度に保ち、さらに8〜10時間、3時間以内に摂氏マイナス60度までウォームアップします。

容器内のFSF溶液1を予冷したアセトンと交換し、摂氏マイナス60度で1時間インキュベートします。このアセトン洗浄を2回繰り返します。3時間以内に摂氏マイナス30度まで温めます。

その間、2ミリリットルのFSF溶液2を2ミリリットルの遠沈管でマイナス30°Cで調製し、予冷します。アセトンをFSF溶液2に交換し、摂氏マイナス30度で3時間インキュベートします。次に、容器内のFSF溶液2を予冷したアセトンと交換し、摂氏マイナス30度で30分間インキュベートします。

このアセトン洗浄を2回繰り返します。2時間以内にマイナス30〜4°Cまで温めます。アセトンを2ミリリットルの0.2モルHEPESバッファーに置き換えます。

バッファーを一度交換し、室温または摂氏4度で一晩インキュベートします。