Gold Nanoparticle Synthesis for Mammalian Cells Using Sapphire Discs

安定なHeLa細胞を含む予め調製したHPFおよびFSF処理サファイアディスクを採取し、PBS-Aバッファーで5分間洗浄し、このプロセスを3回繰り返します。サファイアディスクを、室温で1ミリリットルのPBS-Aバッファーを含む35mm培養皿に移します。培養皿内のPBS-Aバッファーを1ミリリットルの還元溶液に交換し、室温で1時間インキュベートします。

1ミリリットルの還元溶液で金前駆体を調製し、直ちにボルテックスによって混合する。80マイクロリットルの500ミリモルD-ペニシラミンを二重蒸留水中で金前駆体溶液に加えます。そしてすぐに渦。

培養皿の溶液を1ミリリットルの金前駆体溶液と交換し、摂氏4度で2時間インキュベートします。新たに調製した水素化ホウ素ナトリウム溶液を金前駆体溶液に20〜100マイクロリットル加え、直ちに振とうしてよく混合し、室温で5分間インキュベートする。溶液を2ミリリットルのPBS-Aバッファーで交換して反応を停止します。

次に、製造元の指示に従ってエポキシ樹脂混合物を調製し、サファイアディスクを平底埋め込みカプセルに移し、室温で少なくとも30分間樹脂を浸透させます。試料をオーブンで摂氏60度で少なくとも18時間重合します。サファイアディスクを露出させるためにかみそりを使用して試験片ブロックを注意深くトリミングすることにより、重合試料の超薄切片を準備します。

サファイアディスク付きのブロックチップを液体窒素に数秒間浸し、室温で解凍します。フリーズ解凍操作を数回繰り返して、ディスクをブロックから取り外します。EGFP-MTn-KDELタンパク質は、ER末梢管腔および核膜の核周囲空間にのみ分布する2〜5ナノメートルサイズの金ナノ粒子として現れた。

保存状態の良い超微細構造により、タグ付きタンパク質の単一分子同定が可能になり、ERミトコンドリア相互作用などのオルガネラ相互作用の分析が容易になりました。Ost4-EGFP-MTnタンパク質のナノ粒子は、核膜の外膜の小胞体膜を描いた。同様に、Mito-acGFP-MTn発現細胞は、ミトコンドリアマトリックスにおいて特異的標識を示した。