サザンブロッティングを行うには、ナイロンメンブレンを10 x 12センチメートルのサイズのセグメントに切断することから始めます。ゲルと同じ位置にノッチを作ります。メンブレンを蒸留水に浸し、続いて20Xクエン酸ナトリウム塩水バッファーに浸してメンブレンを活性化します。
ろ紙の芯を二重反転トレイに置き、端が外側トレイのベースに触れるように設定します。ろ紙の上にゲルを置きます。次に、活性ナイロンメンブレンをゲルの上に置き、ノッチが重なるようにします。
ガラス棒で気泡を取り除きます。9.5 x 11.5センチメートルサイズのセルロース濾紙の2センチメートルのヒープと、通常のろ紙の別の6センチメートルのヒープを置きます。均等な重量配分のためにセットアップの上に重りを置きます。
外側トレイに20Xクエン酸ナトリウム食塩水バッファーを満たし、効率的に移動するために一晩放置します。サザン転写後、転写されたDNAをUVトランスイルミネーターのUV架橋によりメンブレンに固定します。25ミリリットルの2Xクエン酸ナトリウム生理食塩水でメンブレンを2回洗浄します。
ハイブリダイゼーションを行うには、予め加温したプレハイブリダイゼーションバッファー中でメンブレンをインキュベートする。頻繁に手動でメンブレンを静かに攪拌します。次いで、ブロットを10ミリリットルのハイブリダイゼーションバッファー中で摂氏42度で3時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートする。
ブロットを25ミリリットルのストリンジェントバッファーで室温で10分間穏やかに攪拌しながら2回洗浄します。次に、ブロットを25ミリリットルの予熱したストリンジェントバッファーで摂氏50度で15分間穏やかに攪拌しながら2回洗浄します。15ミリリットルの洗浄バッファーで室温で穏やかに攪拌しながら5分間すすぎます。
メンブレンを10ミリリットルの新たに調製したブロッキング溶液中で、室温で30分間、穏やかに攪拌しながらインキュベートします。次に、アルカリホスファターゼ作業溶液と結合させた10ミリリットルの抗ジゴキシゲニンに入れます。ブロットを洗浄バッファー中で室温で15分間2回洗浄します。
次に、10ミリリットルの検出バッファー中で室温で5分間インキュベートします。余分なバッファーを除去した後、DNA側を上に向けてメンブレンをアセテートシートに置きます。約1〜1.5ミリリットルの基質溶液をメンブレン上に滴下する。
すぐに別のアセテートシートをその上に置き、室温で5分間インキュベートします。イメージングする前に、余分な基質溶液を絞り出します。ゲルドキュメンテーションイメージングシステムを使用して、分析のために異なる時点で複数の不飽和画像を収集します。
サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションの後、テロメア制限断片ははっきりと見え、塗抹標本によって示されました。
