5, 000人の若年成人Caenorhabditis Elegansワームからのクロマチン架橋および核収集の1日目に、450マイクロリットルのきれいな水に再懸濁した核ペレットをきれいな1.5ミリリットルのマイクロ遠心管に移す。次に、60マイクロリットルの10X DPN2制限酵素バッファーをそれに加え、よく混合します。サンプルを15マイクロリットルの10%ドデシル硫酸ナトリウムで摂氏37度で1時間攪拌しながらインキュベートします。
75マイクロリットルの20%トリトンX100を添加し、前述のようにインキュベートすることにより、反応を停止します。未消化コントロールとしてサンプルから10マイクロリットルを分注し、摂氏4度で保存します。残りのサンプルに400単位のDPN 2を加えた後、クロマチン消化のために攪拌しながら摂氏37度で一晩インキュベートします。
2日目に、さらに200単位のDPN 2をサンプルに追加します。架橋サンプルの分解を完了するには、摂氏37度で4時間撹拌しながらインキュベートします。サンプルを摂氏65度で20分間インキュベートすることにより、制限酵素を熱失活させます。
酵素が熱で失活できない場合は、80マイクロリットルの10%ドデシル硫酸ナトリウムを加えてインキュベートします。次に、375マイクロリットルの20%Triton X 100をサンプルに加え、渦巻いて混合します。消化制御として、サンプルから10マイクロリットルのアリコートを取っておきます。
クロマチンライゲーションの場合は、サンプルを清潔な50ミリリットルのコニカルチューブに移します。分子グレードの水でサンプル量を5.7ミリリットルに調整し、渦巻いて混合します。次に、700マイクロリットルの10 X T4リガーゼバッファー、続いて60単位のT4 DNAリガーゼを加え、サンプルを摂氏16度で一晩インキュベートします。
3日目に、タンパク質の消化と逆架橋に進みます。3Cサンプルに30マイクロリットルの10ミリグラム/ミリリットルのプロテイナーゼKを加え、攪拌しながら摂氏65度で一晩インキュベートします。4日目に3Cライブラリの精製を開始するには、30マイクロリットル10ミリグラム/ミリリットルのRNase Aをサンプルに加え、旋回させて混合します。
インキュベーション後、7ミリリットルのフェニルクロロホルムをサンプルに加え、振とうして混合します。サンプルを3, 270 Gおよび室温で15分間遠心分離します。水相を集めてきれいな50ミリリットルの円錐管に移します。
等量のクロロホルムを加え、振とうしてサンプルを混合します。示されているようにサンプルを再度遠心分離した後、水相を別のきれいな50ミリリットルのコニカルチューブに移します。7.5ミリリットルの分子グレードの水、35ミリリットルの100%エタノール、および1ミリリットル1ミリグラムあたり7マイクロリットルの1ミリグラムグリコーゲンを追加します。
適切に混合されたサンプルを摂氏マイナス80度で凍結します。サンプルが凍結している間に、分子グレードの水を使用してコントロールの容量を500マイクロリットルに調整して、コントロールサンプルの精製を開始します。1ミリリットルあたり10ミリグラムのRNase Aを2マイクロリットル加え、チューブをフリックして混合します。
次に、コントロールを含むチューブに1ミリリットルのフェニルクロロホルムを加え、振とうして混合します。チューブを遠心分離します。水相を清潔な1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移した後、等量のクロロホルムを加えます。
水相を回収する前に先に実証したように遠心分離機。回収した水相に、1ミリリットルのエタノールと2マイクロリットルの1ミリグラム1ミリグラムのグリコーゲンを加える。振とうしてサンプルを混合した後、マイナス80°Cで30分間インキュベートします。
次に、サンプルを4°Cで3, 270 Gで15分間遠心分離します。上清を除去した後、750マイクロリットルの冷やした70%エタノールを加えて遠心分離します。風乾ペレットを50マイクロリットルの分子グレードの水に再懸濁します。
すぐに先に進まない場合は、ここで懸濁液を凍結することができます。3Cサンプル精製を続行するには、サンプルを冷凍庫から取り出し、3, 270 Gで30分間遠心分離します。10ミリリットルの冷やした70%エタノールを加え、DNAペレットを分解します。
遠心分離して上清を除去した後、サンプルを室温で部分的に風乾します。このペレットを150マイクロリットルの10ミリモルトリスHCLに再懸濁し、上下にピペッティングすることによりpH 7.5で精製3Cライブラリーを得た。1つの実験サンプルと2つのコントロール3Cサンプルで実行されたQPCRは、消化効率データの生成に役立ちました。
3Cサンプルは、テストされた7つのゲノム遺伝子座全体で約88%の消化効率を示しました。
