この作業は、助成金番号P20GM103430の国立衛生研究所の国立総合医学研究所のロードアイランド機関開発賞(IDeA)ネットワークオブバイオメディカルリサーチエクセレンスとブライアント健康行動科学センターによって部分的にサポートされました。

学部研究および教育のための染色体コンフォメーションキャプチャー(3C)

<ol>
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J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology:+From+fixation+to+computation.">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li><li>Fern&#225;ndez-Mi&#241;&#225;n, A., Bessa, J., Tena, J. J., G&#243;mez-Skarmeta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+21+-+Assay+for+transposase-accessible+chromatin+and+circularized+chromosome+conformation+capture,+two+methods+to+explore+the+regulatory+landscapes+of+genes+in+zebrafish.">Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).</li><li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three+&amp;#34;C&amp;#34;+s+of+chromosome+conformation+capture:+controls,+controls,+controls.">The three &amp;#34;C&amp;#34; s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).</li><li>Hag&#232;ge, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+(3C-qPCR).">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li><li>Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=My5C:+Webtools+for+chromosome+conformation+capture+studies.">My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies.</a> Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).</li><li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression.">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).</li></ol>

著者は利益相反を宣言しません。

3Cは、基本的な分子技術に根ざした強力な技術です。3Cを学部生で使用するのに非常に興味深い手法にしているのは、この基本的なツールの基盤です。近年、クロマチン動態をこのように広範囲に観測する研究が数多く行われているため、これらの結果を用いて、単一の遺伝子またはゲノム領域に関する焦点を絞った実験を考案することは、学部研究においてユニークで影響力のある実験を生み出す可能性を秘めています。多くの場合、このような実験は学部生には高度すぎると考えられていますが、慎重に計画すれば、簡単に達成できます。3Cライブラリによって捕捉されたクロマチン結合をプローブするように設計されたアッセイは、半定量的エンドポイントPCRから全ゲノムシーケンシングまでさまざまであることに注意することが重要です。実際、最初の3C論文16 からのデータはqPCRから生成された。この幅広いアッセイは、すべての3C技術が同じ製品(核内の3D結合を表すDNA断片のライブラリ)を生成するため、すべて使用できます。
ここに提示されるのは、学部生の研究者により適した、より柔軟で収容可能なプロトコルの適応です。上記の一時停止期間は、夜間の遅延を意味します。ただし、これらの一時停止は週末にまたがり、細胞や核の場合は数週間続く可能性があります。最も重要な考慮事項は、作業がいつ完了するかです。多くの場合、プロトコルでは、一時停止がオプションではない場合、時間に敏感な手順があります。いくつかのポイント(1日目と2日目)以外に、サンプルを停止して凍結する場所がたくさんあります。これらは、ラボ作業のスケジュールとタイミングを柔軟にする必要がある学部生と協力する場合に重要です。これらのストップをプロトコルにエンジニアリングすることに加えて、学部生はペアまたは3人または4人の小グループで作業することが奨励されています。このプロトコルでは、生徒がお互いをサポートし、バディシステムを作成して全員が安全に作業できるため、グループはうまく機能します。ラボワークも、他の人が関わるともっと楽しくなります。グループを使用すると、学生は同じプロトコルを実行しながら、クロマチンの構成に焦点を当てたさまざまな質問に取り組むこともできます。したがって、学生が別々のプロジェクトに取り組んでいる間でさえ、プロトコルは彼らの努力を結びつけます、そしてこれのために、彼らはお互いをサポートすることができます。
他の適応は、特定の特殊なツールや機器が必ずしもすべての学部機関にあるとは限らないという事実を回避することを目的としています。これらの機器には、qPCRサーモサイクラー、ゲルドキュメンテーションシステム、およびナノ体積分析計が含まれますが、これらに限定されません。確かに、これらの機器は便利ですが、必須ではありません。ここで、3Cの古典的な方法は、プライマー設計部分でも説明されています。これには、目的のゲノム遺伝子座を特定し、そこから、さらに離れたクロマチン接触点について他のゲノム遺伝子座を評価することが含まれます。この手法は、既知の陽性(接続)および負(非接続)遺伝子座が識別されるHi-Cを使用するデータセットなど、公開されたデータセットを使用する場合にもうまく機能します。これらの公開データセットを使用して実験を設計することは、クロマチン結合の同定が成功する可能性が通常高いため、教育ラボへのもう一つの大きな適応です。また、研究論文は授業で議論し、参考にすることができます。
このプロトコルは、修正qPCRアプローチを使用して、3C産物の形成を視覚化します。コントロールは、3C技術の成功に不可欠です。各実験では、サンプルコントロールとプライマーコントロールの両方を使用して、3C手順の完了を判断します。サンプルコントロールには、未消化コントロール(ゲノムDNA)および消化コントロールが含まれます。未消化コントロールは、プライマーセットのベースラインシグナルを決定し、消化効率を決定するために架橋消化コントロールとともに使用され、制限部位を横切るプライマーの生成物の低下が予想される。この値を未消化のコントロールと比較すると、サンプルがどれだけよく消化されたかがわかります。
PCR用のプライマーとしては、コントロールプライマーおよびテストプライマーが挙げられる。コントロールプライマーは、アッセイ対象のゲノム領域の近くにあり、制限部位を含まないプライマーセットです。これは、テストプライマーPCR産物の存在量を決定するためのベースラインを提供します。テストプライマーは、目的の特定のゲノム遺伝子座の制限部位に隣接するフォワードプライマーおよびリバースプライマーです(図3)。これらのプライマーセットを使用した反応を比較して消化効率を決定し、制限部位が切断された場合に生成物の存在量が低下するはずです。クロマチン組織を決定する際には、ある遺伝子座からの1つのテストプライマーを異なるゲノム遺伝子座からの別のテストプライマーとペアにして、これら2つの遺伝子座が3D空間で互いに近接しているかどうかを判断します。その場合、PCR産物は3Cサンプルをテンプレートとして使用してのみ見つかることが期待されます。
バリデーションされたプライマーでさえ失敗する傾向があることに注意することが重要です(図4:r14プライマーセット)。さらに、PCR産物は、対照反応およびクロマチン結合が予測されない反応(ライゲーションされていないため消化された対照など)で頻繁に同定されます。これらのインスタンスはシーケンスされ、サンガーQCに失敗するか、定義されたシーケンスなしで戻ります(図5)。さらに、従来の3C実験では、架橋、消化、ライゲーションされていないDNAサンプルである「コントロールテンプレート」が生成され、一定量のDNAで生成できるすべてのライゲーションフラグメントを表します。「コントロールテンプレート」は、2つのゲノム遺伝子座間でqPCRシグナルの強度を比較して、シグナルが真の相互作用を表すのか、それとも単なるランダムな関連を表すのかを判断する上で重要な役割を果たします。アッセイ対象のクロマチンの大部分を人工染色体の形で捕捉し、3Cサンプルと一緒に処理する必要があるため、「コントロールテンプレート」の作成には問題があります。そのような構造を確保することは実行不可能である可能性があり、それを作成することは学期プロジェクトの範囲外である可能性があります。これらの困難のため、コントロールプライマーの使用をお勧めします。コントロール入門書は、「コントロールテンプレート」のすべての機能を置き換えるものではありませんが、データを分析して「存在」または「不在」の判断を行う機会を提供します。
qPCRを行う場合は、等量のサンプルを使用することが重要です。これは、ナノドロップなどのナノ分光光度計を使用する場合でも、既知の濃度のゲノムDNAから標準曲線を生成し、3Cサンプルをその線に適合させることによって決定する必要があります。これらの金額は記録し、その後のPCRで使用する必要があります。PCR反応の質も重要です。PCRがqPCRで実行されると、生成物の存在量が蛍光を使用して測定され、記録されます。この記録は、増幅プロットでアクセスできます。プログラムが終了したら、増幅プロットをチェックし、反応(テンプレートなしコントロールを除く)にベースライン、指数、プラトー/飽和フェーズの3つのフェーズがあることを確認することが重要です。特に閾値を設定するために、反応が指数関数的位相を有することを確認することは重要である(下記参照)。さらに、連続希釈サンプルの場合、サンプルの希釈と一致するCt値のシフトが必要です(最高濃度は最も低いCt値を持ち、最も低い濃度は最高のCt値を持ちます)。増幅プロットにこの変化を反映していないサンプルは、新しい希釈を必要とするか、3Cサンプル形成に関するより大きな問題を示しています。最後に、検量線を生成する間、PCRソフトウェアはPCR効率とR2 値を計算します。PCR効率は90%より大きくなければならず、R2 値は0.99より大きくなければならない。これらの条件のいずれかが満たされない場合は、サンプルまたはPCRプライマーに問題がある可能性があります。
qPCR後、消化率および3C相互作用の存在は、各反応のqPCRを用いて計算することができる。これらを決定するには、まずPCR反応の閾値を設定する必要があります。これは通常、qPCRマシンに付属のソフトウェアを使用して行われます。閾値を設定すると、サンプルCt値の比較に使用されるPCR産物の濃度が定義されます。閾値は、増幅の指数関数的段階におけるPCR反応の増幅曲線を二等分する必要があります。指数関数的増幅を伴うPCR反応(この場合、コントロールプライマーとテストプライマー反応)のみが比較でき、これは反応が同じ速度でDNAを増幅し、忠実に比較できることを確認する唯一の方法であるためです。3Cグラフを分析すると、条件付き陽性反応は、対照サンプル、ゲノム制御、および消化制御よりも多くの生成物を有するものとして識別されます(図4B)。ただし、これらのサンプルは、PCR産物のゲル精製に続いてサンガーシーケンシングを使用してさらに検証する必要があります。
サンガーシーケンシング後、QCに合格したサンプルはBlatを使用して分析できます。この分析の目的は、サンプルが制限部位に隣接する両方の標的ゲノム遺伝子座(このプロトコルの場合はDpnII)の配列を持っているかどうかを判断することです。両方の配列が同定された場合、3Cフラグメントはバリデーション済みと見なすことができる。Blatの結果が期待される配列を返さない場合、これは一方または両方のプライマーが最適ではなく、偽陽性のqPCR結果をもたらすことを示している可能性があります。偽陽性サンプルのトレース ファイルには未定義のベース ピークがあり、Seq レポートにはほとんど "n" 個のベース コールが含まれます。
サンガーバリデーションは、人工PCR産物形成による偽陽性の可能性があるため、不可欠です。これらの偽陽性は、シーケンシング産物が期待される標的配列または適切な3Cフラグメントに特徴的なDpnII部位を持たない場合に特定できます(図5)。PCRフラグメントのシーケンシングは、実験のための別のデータポイントも提供し、3C技術が核内の3D空間に集まっている遠隔のゲノム遺伝子座を識別していることを学生に思い出させます。
3C技術は、柔軟で簡単な手順で学部生に豊富な基礎分子技術を提供します。この3C技術は、次世代シーケンシング(NGS)を組み込んだ他の3C技術の出発点でもあります。これらのタイプの実験は、学部生をバイオインフォマティクスの重要な側面にさらすことができ、ここで概説されている基本原則に根ざしています。学部での経験と関与は、若い科学者としての成功と発展の鍵です。これらの機会を提供することで、学部生は基本的な原則の理解を深めながら、最先端の技術や質問に取り組む自信を築くことができます。

生物のゲノムは、機能に必要なすべての遺伝子だけでなく、それらをいつどのように使用するかについてのすべての指示も保持しています。これにより、ゲノムへのアクセスを調節することは、細胞の最も重要な機能の1つになります。遺伝子機能を制御するメカニズムはたくさんあります。しかし、その基本レベルでは、遺伝子調節は、調節転写因子(トランス因子)がそれらの特定のDNA配列(シス調節配列)に結合する能力に帰着する。これは生来の能力ではありません。代わりに、核内のゲノムの構成/構造によって制御され、トランス因子1,2,3に対するシス調節配列の利用可能性/曝露を制御します。トランスファクターがシス調節配列を見つけることができない場合、トランスファクターは調節タスクを実行できません。これにより、ゲノムが核内でどのように構成されているかを理解することが重要な研究の源となっています。
間期には、核内の真核生物の染色体が核膜と核マトリックスに固定された独自のドメインを占めるため(図1)、染色体はスパゲッティの皿の上の麺ではなく、ピザのスライスのようになります。染色体は、染色体の部分をねじったりループしたりするタンパク質-DNA相互作用(クロマチン)によって部分的に凝縮されます。電子顕微鏡、三次元DNA蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、およびDNAタグ付け技術(すなわち、蛍光および人工DNAメチル化)により、クロマチンの不活性ドメインは核周辺に沿って密集していることが見出されています4,5,6、一方、活性で凝縮性の低いクロマチンの一部は核の内部に見られます7,8,9、10.これらの実験は、染色体動態の広角図を提供するが、DNase11、12およびヌクレオソーム13、14、15の研究で観察された遺伝子前運動の周囲で局所的に起こる変化を捉えることはほとんどない。
より高解像度のクロマチン動態を解き放つ鍵は、3D染色体マッピング技術である3Cの定式化でした。3C技術自体は、クロマチンの架橋、制限酵素によるクロマチン消化、クロマチンライゲーション、DNA精製の4つの主要なステップで構成されています(図2)。次いで、このプロセスによって生成された新しい人工DNA断片を特徴づけて、直線的に離れたDNA断片間の密接な物理的関連を明らかにすることができる16。3C技術は、3Cの初期ステップを利用してより広いゲノム全体の質問をする複数のスピンオフ技術(Hi-C、4C、ChIP-Cなど)を作成するための基礎となりました。この3C技術ファミリーは、染色体がトポロジー関連ドメイン(TAD)と呼ばれる複数の個別の単位に編成されていることを特定しました。TADはゲノムにコードされており、ループのない境界に隣接するクロマチンループによって定義されます16、17、18、19。TAD境界は、CCCT結合因子(CTCF)と凝集力を含む2つの進化的に保存された遍在する因子によって維持され、別々のTAD内のループが相互作用するのを防ぎます16,20。ループは、トランスファクターとその調節配列との相互作用、ならびにCTCFおよび凝集力21によって媒介される。
3C技術を用いた多くの研究は、ゲノム全体の幅広い質問をし、複雑なサンプル収集技術を採用していますが、3C技術の定式化は基本的な分子生物学的手法に基づいています。これにより、3Cは学部の研究ラボと教育ラボの両方での展開に興味をそそられます。3C手法は、より小さな焦点を絞った質問に採用でき、質問の焦点と方向に応じて、スケールアップまたはスケールダウン(単一遺伝子22、染色体16、および/またはゲノム18)に本質的に柔軟です。この技術は、幅広いモデルシステム7、16、19、23にも適用されており、その使用において汎用性があることが証明されています。これにより、3Cは、学生が一般的な分子生物学技術の経験を積むと同時に、指示された質問に答える貴重な経験を積むことができるという点で、学部生にとって優れた技術になります。
ここに提示されるのは、以前に公開されたプロトコル24、25、26、27に基づく3Cライブラリ調製に適合したプロトコルである。このプロトコルは、約1×107細胞に最適化されていますが、わずか1×105細胞で3Cライブラリを生成しています。このプロトコルは汎用性が高いことが証明されており、ゼブラフィッシュ胚、ゼブラフィッシュ細胞株、および若年成人(YA)のカエノラブディティスエレガンス(回虫)から3Cライブラリを生成するために使用されています。このプロトコルは、哺乳類細胞株、およびさらに適応して酵母にも適切である必要があります。
これらの適応の目標は、学部生が3Cにアクセスしやすくすることです。学部の教育研究室で達成できるものと同様の技術を使用するように注意が払われています。3C技術は、学部生がベンチ、教室、および卒業後の努力において彼らの発達に役立つ基本的な分子生物学技術を学ぶための多くの学習機会を提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>215350280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>COEDTAF-RO</td>
			<td>mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td>1 M stock diluted to 500 &#181;M in Sucrose buffer and GB buffer fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycogen</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl green pyronin&#160;&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>HT70116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>1222530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol-chloroform&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>11459643001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB05406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Ready mix (Phire Taq etc)</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>KCQS07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>R6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>108319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

getting an a with the 3cs: chromosome conformation capture for undergraduates

染色体コンフォメーションキャプチャ(3C)は、クロマチンの3次元構成の詳細な情報を提供する同様の技術(たとえば、Hi-C、4C、および5C、ここでは3C技術と呼びます)のファミリーを生み出した強力なツールです。3C技術は、がん細胞におけるクロマチン組織の変化のモニタリングから、遺伝子プロモーターとのエンハンサー接触の同定まで、幅広い研究で使用されています。これらの手法を用いた研究の多くは、複雑なサンプルタイプ(すなわち、シングルセル解析)でゲノム全体の大きな質問をしていますが、しばしば失われているのは、3C技術が幅広い研究に適用できる基本的な分子生物学的手法に基づいていることです。クロマチン構成の焦点を絞った質問に取り組むことにより、この最先端の手法を使用して、学部の研究と教育ラボの経験を向上させることができます。この論文は、3Cプロトコルを提示し、学部の研究および教育経験において主に学部機関で実施するための適応と強調点を提供します。

An organism&#39;s genome not only holds all the genes required for function but also all the instructions on how and when to use them. This makes regulating access to the genome one of the most important functions of the cell. There are many mechanisms to control gene function; however, at its base level, gene regulation comes down to the ability of regulatory transcription factors (trans-factors) to bind to their specific DNA sequences (cis-regulatory sequences). This is not an innate ability; instead, it is governed by the organization/structure of the genome in the nucleus, which controls the availability/exposure of the cis-regulatory sequences to the trans-factors1,2,3. If the trans-factors cannot find their cis-regulatory sequences, then the trans-factors cannot perform their regulatory tasks. This has made understanding how genomes are organized in the nucleus an important source of inquiry.
It is widely accepted that during interphase, eukaryotic chromosomes in the nucleus occupy their own domain anchored to the nuclear lamina and nuclear matrix (Figure 1), thus making the chromosome more like a slice of pizza, rather than a noodle on a plate of spaghetti. Chromosomes are partially condensed by protein-DNA interactions (chromatin) that twist and loop portions of the chromosome. Through electron microscopy, three-dimensional DNA fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA tagging techniques (i.e., fluorescent and artificial DNA methylation), inactive domains of chromatin have been found to be packed tightly along the nuclear periphery4,5,6, while portions of active, less condensed chromatin are found in the interior of the nucleus7,8,9,10. These experiments provide a wide-angle view of chromosome dynamics but do little to capture the changes that occur locally around the gene promotors observed in DNase11,12 and nucleosome13,14,15 studies.
The key to unlocking higher-resolution chromatin dynamics was the formulation of the 3D chromosome mapping technique, 3C. The 3C technique itself comprises four main steps: crosslinking of chromatin, chromatin digestion by restriction enzymes, chromatin ligation, and DNA purification (Figure 2). The new artificial DNA fragments generated by this process can then be characterized to reveal the close physical association between linearly distant pieces of DNA16. The 3C technique became the basis for the creation of multiple spin-off techniques that utilize the initial steps of 3C to ask broader genome-wide questions (e.g., Hi-C, 4C, ChIP-C). This family of 3C techniques has identified that chromosomes are organized into multiple discrete units termed topologically associated domains (TADs). TADs are encoded in the genome and are defined by chromatin loops flanked by unlooped boundaries16,17,18,19. The TAD boundaries are maintained by two evolutionarily conserved and ubiquitous factors, including CCCT binding factor (CTCF) and cohesion, which prevent loops within separate TADs from interacting16,20. The loops are mediated by the interaction of trans-factors with their regulatory sequences, as well as CTCF and cohesion21.
Though many studies using 3C technologies ask broad genome-wide questions and employ complicated sample collection techniques, the formulation of the 3C technique is based on basic molecular biology techniques. This makes 3C intriguing for deployment in both undergraduate research and teaching labs. The 3C technique can be employed for smaller focused questions and is inherently flexible to scaling up or down (single genes22, chromosomes16, and/or genomes18) depending on the focus and direction of the questions asked. This technique has also been applied to a wide range of model systems7,16,19,23 and has been proven to be versatile in its use. This makes 3C an excellent technique for undergraduates in that students can gain experience in common molecular biology techniques while also gaining valuable experience in answering directed questions.
Presented here is an adapted protocol for 3C library preparation based on previously published protocols24,25,26,27. This protocol has been optimized for approximately 1 &#215; 107 cells, though it has generated 3C libraries with as little as 1 &#215; 105 cells. This protocol has proven to be versatile and has been used to generate 3C libraries from zebrafish embryos, zebrafish cell lines, and young-adult (YA) Caenorhabditis elegans (roundworm). The protocol should also be appropriate for mammalian cell lines and, with further adaptation, yeast.
The goal of these adaptations is to make 3C more accessible for undergraduates. Care has been taken to use techniques that are similar to those that can be accomplished in an undergraduate teaching laboratory. The 3C technique provides many learning opportunities for undergraduates to learn basic molecular biology techniques that will benefit their development at the bench, in the classroom, and in their endeavors after graduation.

著者スポットライト:3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ  

3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

Our research aims to uncover how chromatin organization controls gene expression. The focus is on determining what factors regulate chromatin at the gene level to control gene activity. Currently, technologies similar to chromosome confirmation capture, or 3C, are used to make progress in this field.Investments in sample collection and sequencing technologies have pushed us what the 3C techniques can show us. The greatest experimental challenge currently is collecting samples having uniform chromatin architecture. Heterogeneity in samples leads to confounding results.In the future, we'll be focusing on how changes in chromatin organization play a role in cancer.

この手順では、1つの実験的3Cサンプルと2つの対照サンプル(未消化および消化)が生成されます。これら3つのサンプルを用いて、qPCRを実施した。これらの結果から、消化効率を算出し(式1)、記録した(表1)。これらの計算から、3Cサンプルは、テストされた7つのゲノム遺伝子座にわたって約88%の消化効率(表1の平均)を有すると決定された。
次に、遺伝子座特異的プライマー(表2)とqPCRの組み合わせを使用して、サンプルを異なるゲノム遺伝子座間の長距離クロマチン接触の存在についてテストしました。これらの結果を使用して、対照プライマーセットに対する生成物存在量を計算(式 2)し、比較のためにグラフ化しました(図4)。これらのデータは、10の反応のうち8つが長距離相互作用の条件付き陽性であることを示しました。
次に、PCR反応をアガロースゲル上で実行しました。8つの条件付き陽性反応と1つの陰性反応について予想されるPCR産物をゲル精製し、サンガーシーケンシングに送りました。代表的な陽性反応(青矢印、青ボックス)と陰性反応(赤矢印、赤ボックス)の結果を示します(図5)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig01.jpg"> 図1:核内の染色体構造。 核内の仮想的な染色体組織。(A)核エンベロープ、黒い線。(b)核ラミナ、オレンジ;(c)ヘテロクロマチン、圧縮系統;(D)ユークロマチン、ルーズループ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig02.jpg"> 図2:3Cプロトコルの概略図。線状染色体の遠い部分(青、黄、ピンク)は、調節ループを介して核内で互いに接近します。(A)ループ構造は転写因子(灰色の円と黒い星)によって媒介されます。これらの相互作用は、化学的架橋によって維持されます。(B)ループは酵素消化によって切断されます(黒い線)。(C)離れたクロマチン片は、消化によって作られた固着端を通して一緒に結紮されます。(d)DNAがタンパク質から精製されている。(E)断片内の配列が同定され、ゲノムにマッピングされます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig03.jpg"> 図3:3Cプライマースキーム。 3Cプライマーは、目的のゲノム位置からさまざまな距離にある制限部位を中心に設計されています。ピンク色の矢印は、DpnII部位を囲む実験用プライマーセットを表す。実験用プライマーを混合してマッチングさせ、その領域のクロマチンループを評価することができます。オレンジ色のプライマーは、DpnII部位を持たない陰性対照を表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig04.jpg"> 図4:3C実験の代表的なqPCRデータ。 3Cテストプライマーセットの相対的な存在量。(A)未消化コントロール(青)、消化コントロール(灰色)、および3Cサンプル(オレンジ)における生成物の相対存在量を示すコントロールグラフ。(b)前記3C実験;未消化コントロール(青)、消化コントロール(灰色)、および3Cサンプル(オレンジ)におけるテストプライマーの組み合わせからの生成物の相対存在量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig05.jpg"> 図5:3C qPCR産物の可視化。 一番上に、示されたサンプルを含むqPCRエンドポイント製品でゲル化します。下段に、示された反応についての代表的なサンガー配列トレースファイル。オレンジ色のサンプルは偽陽性の例であり( 図4、 r38/34を参照)、青色のサンプルは、トレースの上にDpnII部位が示されている真陽性の例です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>敷地</td>
			<td>%消化</td>
		</tr><tr><td>R8</td>
			<td>86.98</td>
		</tr><tr><td>R3</td>
			<td>88.44</td>
		</tr><tr><td>R38</td>
			<td>89.64</td>
		</tr><tr><td>R34</td>
			<td>87.55</td>
		</tr><tr><td>R33</td>
			<td>87.85</td>
		</tr><tr><td>R14</td>
			<td>86.97</td>
		</tr><tr><td>R47</td>
			<td>89.45</td>
		</tr></tbody></table>表1:計算された消化効率。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>名前</td>
			<td colspan="3">順序</td>
			<td>ゲノム遺伝子座</td>
		</tr><tr><td>r3 FWD</td>
			<td colspan="3">ACGCAAGTAAAATTGGTTTTTGACC</td>
			<td>chrX:11361475</td>
		</tr><tr><td>r3 RVS</td>
			<td colspan="3">TTTCCTGAGCTCTTAACCATGTTTGC</td>
			<td>chrX:11361561</td>
		</tr><tr><td>r38 FWD</td>
			<td colspan="3">TTACTTCTGAAGTAATTTTTTTCCCC</td>
			<td>chrX:5859700</td>
		</tr><tr><td>r38 RVS</td>
			<td colspan="3">アガガグクガ</td>
			<td>chrX:5859775</td>
		</tr><tr><td>r34 FWD</td>
			<td colspan="3">ATTTGTGGATTGCGTGGAGAGAGG</td>
			<td>chrX:5429702</td>
		</tr><tr><td>r34 RVS</td>
			<td colspan="3">AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC</td>
			<td>chrX:5429777</td>
		</tr><tr><td>r33 FWD</td>
			<td colspan="3">AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC</td>
			<td>chrX:6296704</td>
		</tr><tr><td>r33 RVS</td>
			<td colspan="3">TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG</td>
			<td>chrX:6296807</td>
		</tr><tr><td>r14 FWD</td>
			<td colspan="3">AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG</td>
			<td>chrX:8036367</td>
		</tr><tr><td>r14 RVS</td>
			<td colspan="3">ATTTCAATGAAAATGTAAAATTCCTTCTCTCTCTCT</td>
			<td>chrX:8036427</td>
		</tr><tr><td>r47 FWD</td>
			<td colspan="3">ATCTAGACTTGATAATATTGTGTGTCCTC</td>
			<td>chrX:9464939</td>
		</tr><tr><td>r47 RVS</td>
			<td colspan="3">AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC</td>
			<td>chrX:9465064</td>
		</tr><tr><td>r8 FWD</td>
			<td colspan="3">GAGAATGTGTGTGTGTTAACTGAAAACTTG</td>
			<td>chrX:11094257</td>
		</tr><tr><td>r8 RVS</td>
			<td colspan="3">TTACGAAATTTGGTTTTGGACC</td>
			<td>chrX:11094362</td>
		</tr><tr><td>コントロールプライマーFWD</td>
			<td colspan="3">CAATCGTCTCGCTCACTTGTC</td>
			<td>chrX:7608049</td>
		</tr><tr><td>コントロールプライマー RVS</td>
			<td colspan="3">GATGTGAGCACAAGGCACC</td>
			<td>chrX:7608166</td>
		</tr></tbody></table>表2:代表的な3C実験のためのプライマー。

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ここでは、染色体立体構造捕捉(3C)技術の適応を、学部生の関与と学習に重点を置いて詳細に紹介します。

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

私たちの研究は、クロマチン構成が遺伝子発現をどのように制御しているかを明らかにすることを目的としています。焦点は、遺伝子活性を制御するために遺伝子レベルでクロマチンを調節する因子を決定することにあります。現在、染色体確認捕捉(3C)と同様の技術がこの分野で進歩を遂げるために使用されています。サンプル収集およびシーケンシング技術への投資は、3C技術が私たちに示してくれるものを押し上げました。現在の最大の実験課題は、均一なクロマチン構造を持つサンプルを収集することです。サンプルの不均一性は、交絡結果につながります。将来的には、クロマチン構成の変化ががんでどのように役割を果たすかに焦点を当てる予定です。

getting-an-with-3cs-chromosome-conformation-capture-for

Research

JoVE Journal

Genetics

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

2.1K ビュー.  Bryant University. 私たちの研究は、クロマチン構成が遺伝子発現をどのように制御しているかを明らかにすることを目的としています。焦点は、遺伝子活性を制御するために遺伝子レベルでクロマチンを調節する因子を決定することにあります。現在、染色体確認捕捉(3C)と同様の技術がこの分野で進歩を遂げるために使用されています。サンプル収集およびシーケンシング技術への...

ビデオ: 著者スポットライト:3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ  

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

遺伝学

Generation and Purification of Chromosome Conformation Capture (3C) Library

On day one after chromatin cross-linking and nuclei collection from 5, 000 young adult Caenorhabditis Elegans worms, transfer the nuclei pellet re-suspended in 450 microliters of clean water to a clean 1.5 milliliter micro centrifuge tube. Then add 60 microliters of 10X DPN2 restriction enzyme buffer to it and mix well. Incubate the samples with 15 microliters of 10%sodium dodecyl sulfate at 37 degrees Celsius for one hour with agitation.Quench the reaction by adding 75 microliters of 20%triton X 100 and incubating as demonstrated previously. Aliquot 10 microliters from the sample, as the undigested control, and store it at four degrees Celsius. After adding 400 units of DPN 2 to the rest of the sample, incubate it overnight at 37 degrees Celsius with agitation for chromatin digestion.On day two, add an additional 200 units of DPN 2 to the sample. To complete the digestion of the cross-linked sample, incubate it at 37 degrees Celsius with agitation for four hours. Heat inactivate the restriction enzyme by incubating the sample for 20 minutes at 65 degrees Celsius.If the enzyme cannot be inactivated by heat, add 80 microliters of 10%sodium dodecyl sulfate and incubate. Then, add 375 microliters of 20%Triton X 100 to the sample and mix by swirling. Keep aside a 10 microliter aliquot from the sample as the digestion control.For chromatin ligation, transfer the sample to a clean 50 milliliter conical tube. Adjust the sample volume to 5.7 milliliters with molecular grade water and mix by swirling. Then, add 700 microliters of 10 X T4 ligase buffer, followed by 60 units of T4 DNA ligase, and incubate the sample overnight at 16 degrees Celsius.On day three, proceed with protein digestion and reverse cross-linking. Add 30 microliters of 10 milligrams per milliliter Proteinase K to the 3C sample and incubate at 65 degrees Celsius overnight with agitation. To begin purification of the 3C library on day four, add 30 microliters of 10 milligrams per milliliter RNase A to the sample and mix by swirling.After incubation, add seven milliliters of phenyl chloroform to the samples and mix by shaking. Centrifuge the sample for 15 minutes at 3, 270 G and room temperature. Collect and transfer the aqueous phase to a clean 50 milliliter conical tube.Add equal volumes of chloroform and mix the sample by shaking. After centrifuging the sample again as demonstrated, transfer the aqueous phase to another clean 50 milliliter conical tube. Add 7.5 milliliters of molecular grade water, 35 milliliters of 100%ethanol and seven microliters of one milligram per milliliter Glycogen.Freeze the properly mixed sample at minus 80 degrees Celsius. While the sample freezes, begin purifying the control samples by adjusting the volume of the controls to 500 microliters using molecular grade water. Add two microliters of 10 milligrams per milliliter RNase A and mix by flicking the tube.Next, add one milliliter of phenyl chloroform to the tubes containing the controls and mix by shaking. Centrifuge the tubes. After transferring the aqueous phase to a clean 1.5 milliliter micro centrifuge tube, add equal volumes of chloroform.Centrifuge as previously demonstrated before collecting the aqueous phase. To the collected aqueous phase, add one milliliter of ethanol and two microliters of one milligram per milliliter glycogen. After mixing the sample by shaking, incubate it at minus 80 degrees Celsius for 30 minutes.Next, centrifuge the sample for 15 minutes at 3, 270 G at four degrees Celsius. After removing the supernatant, add 750 microliters of chilled 70%ethanol and centrifuge. Re-suspend the air dried pellet in 50 microliters of molecular grade water.The suspension can be frozen here if not proceeding further immediately. To continue with the 3C sample purification, remove the sample from the freezer and centrifuge at 3, 270 G for 30 minutes. Add 10 milliliters of chilled 70%ethanol and break up the DNA pellet.After centrifuging and removing the supernatant, partially air dry the sample at room temperature. Re suspend the pellet in 150 microliters of 10 millimolar tris HCL at pH 7.5 by pipetting up and down to obtain the purified 3C library. QPCR performed on the one experimental and two control 3C samples helped generate the digestion efficiency data.The 3C sample had an approximately 88%digestion efficiency across the seven genomic loci tested.

染色体立体構造キャプチャー(3C)ライブラリーの生成と精製

Identification of the Chromosome Conformation Capture (3C) Products

Take the chromosome confirmation capture or 3C sample and controls, and perform QPCR. Excise the product bands corresponding to the expected fragment size. To perform gel extraction of the PCR products, use a commercial kit or follow the homemade protocol.For the latter, construct a homemade purification cartridge by poking a hole in the bottom of a 0.5 milliliter tube with a needle. Pack a small amount of cotton into the bottom of the tube with the hole, filling no more than half of the tube. Place the tube into a 1.5 milliliter tube, ensuring that the smaller tube rests on the lip of the bigger tube, and not in the tube.Carefully cut the gel fragment into smaller pieces, and place it in the small tube of the cartridge. Place the assembly in a minus 20 degrees Celsius freezer for five minutes. Then, spin the assembly for three minutes at 13, 000 G and room temperature.Discard the small tube containing the agoros debris, and keep the 1.5 milliliter tube with the extracted DNA in the buffer. The samples were tested for the presence of long range chromatin contacts between the different genomic loci, using combinations of loci-specific primers and QPCR. The product abundance is relative to a control primer set were calculated and graft for comparison.The data indicated that 8 of the 10 reactions were conditional positives. Gel purification and sequencing of the expected PCR product for the eight conditional positives and one negative reaction were gel purified and sequenced. The results for representative positive and negative reactions are shown.