Protocol for Measuring Mitophagy in Caenorhabditis elegans

はじめに、同期した若い成人のC.Elegans雌雄同体をマイクロ遠心管に入れます。ポロクサマー188、プルロニックF127、および2マイクロリットルの染色キット試薬を含む200マイクロリットルのM9バッファーをワームペレットに追加します。染料を光から保護するために、チューブをアルミホイルで覆います。

混合物を室温で20 RPMで1時間回転させます。次に、ワームを500 Gで1分間回転させます。その後、ワームペレットを乱さずに染色液を取り除きます。

ワームをM9バッファーで3回洗浄し、適切な処理を含む播種したNGM寒天プレートに移します。プレートからワームを洗い流し、1ミリリットルのM9バッファーを含む新しいマイクロ遠心チューブに入れます。その後、氷上で1%ホルムアルデヒドでワームを30分間固定します。

そして、1ミリリットルのM9バッファーでワームを3回洗浄して、残留ホルムアルデヒドを取り除きます。ワームをペレット化した後、最大量の上清を吸引し、ペレットを10マイクロリットルのM9に無傷に保ちます。次に、2.5%アガロースを調製するために、0.125グラムのアガロースを10ミリリットルのホウケイ酸ガラス試験管に計量する。5ミリリットルのM9バッファーを加え、ブンゼンバーナーでチューブを穏やかに加熱してアガロースを溶解します。

溶かしたアガロースを75°Cに設定したドライバスに移します。1ミリリットルのチップを使用して、100マイクロリットルの溶融アガロースをデッキグロッサー顕微鏡カバーガラスに加えます。直ちに、十字形を形成するアガロース滴の上に垂直に別のスライドを置く。

2分後、上部カバーガラスを押してスライドをゆっくりと分離し、アガロースパッドを下部カバースライドに残します。パスツールガラスピペットでワームをアガロースパッドに移します。実験室用ワイプで作られた芯を使用して、余分な液体を取り除きます。

次に、小さなカバースリップでワームを覆い、蒸発を防ぐために周囲に透明なマニキュアを塗ります。スライドを暗い箱に入れて、光から保護します。共焦点顕微鏡を使用して、60倍の倍率のレンズを使用して、適切な波長で24時間以内にワームを画像化します。

次に、イメージングソフトウェアを開き、灰色の領域を右クリックします。表示されるポップアップから、[取得]を選択します。Ti2フルパッド。

ND 取得テーブルとルックアップ テーブル。Ti2フルパッドの下で、60回選択し、顕微鏡のファインフォーカスノブを調整して、ワームに焦点を合わせます。次に、スピニングディスクを選択し、16ビット-ビニングなしオプションを選択します。

蛍光フィルターごとに、露光時間を500ミリ秒に設定し、明視野の場合は20ミリ秒に設定します。これらのパラメーターを設定したら、[今すぐ実行] を選択し、出力イメージが ND2 ファイルとして生成されるのを待ちます。