まず、200マイクロリットルの還元血清培地を2マイクログラムの任意のプラスミドDNAと別々に滅菌マイクロ遠心チューブ1で混合します。別々のチューブ内の他の2つのプラスミドについてもこれを繰り返します。次に、新しいチューブ2本で、200マイクロリットルの還元血清培地を6マイクロリットルのトランスフェクション試薬と混合し、ピペッティングで内容物を混合します。
チューブ2の内容物をチューブ1に混合する前に、チューブを室温で5分間インキュベートします。別々のチューブで、他の2つのプラスミドとトランスフェクション試薬の混合を繰り返します。混合物を室温で20分間インキュベートする。
次に、トランスフェクション複合体をHeLa細胞培養播種イメージングディッシュにドロップワイズで添加し、ディッシュ全体に均等に分布するようにします。イメージングの1時間前に、二酸化炭素タンクのバルブを開き、顕微鏡の環境コントローラーをオンにします。タッチパッドの上矢印と下矢印を使用して、温度を摂氏37度に、二酸化炭素を摂氏5%に調整します完了したら、[設定]を押します。
レーザー設定を調整するには、[取得]タブをクリックし、[レーザーの概要を開く]を選択して、白色光レーザーをオンにします。ダイアログボックスで、白色光レーザーをオンに切り替えます。レーザー出力を85%と入力します励起制御ボタンをクリックし、ドロップダウンメニューから最大出力を選択します。
テトラエチルローダミンエチルエステルパーコレートまたはTMREを開始し、励起レーザーを514ナノメートルに設定し、発光スペクトルウィンドウをYFPの524〜545ナノメートルに設定して実験します。次に、MitoTracker Deep Redの場合、励起レーザーを641に設定し、発光スペクトルウィンドウを650〜750ナノメートルに設定します。同様に、TMREの場合、励起レーザーを555ナノメートルに設定し、発光スペクトルウィンドウを557〜643ナノメートルに設定します。
画像取り込みの設定を開始するには、[取り込み]タブを選択し、形式を1024 x 1024に調整します。ドロップダウンメニューで速度を600に調整します。次に、[ライン平均]ボタンをクリックし、ドロップダウンメニューから3つ選択します。
双方向スキャンをオンにし、位相とズーム係数をそれぞれ22.61と1.50に設定します。完了したら、YFP設定をクリックしてFast Liveを押して、YFP蛍光シグナルに基づいて細胞を選択します。次に、YFPのゲインと強度を調整し、YFP蛍光シグナルに基づいて細胞を選択します。
TMRE実験でDMSOコントロールプレートを画像化するには、ミトコンドリアネットワークの強度が飽和のすぐ下になるように、TMRE信号設定2のゲインと強度を調整します。TMREのゲインと強度を一定に保ちます。次に、MitoTracker設定のゲインと強度を調整して、ミトコンドリアネットワークが見えるが暗くなるようにします。
ゲインと強度の設定が完了したら、[開始]をクリックして画像を取り込みます。実験条件ごとに20個の細胞の画像を取得します。
