この原稿に対する思慮深いフィードバックを提供してくれたEvansラボのメンバーに感謝します。この研究は、デュークホワイトヘッド奨学生、デューク科学技術奨学生、およびハワードヒューズ医学研究所(HHMI)ハンナグレイフェローシップによってサポートされています。 図1A は BioRender.com を用いて作製した。

ミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルの定量化

著者には、宣言する競合する利益はありません。

ここで概説するワークフローは、蛍光ベースのイメージングを用いて、ミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルを堅牢かつ再現性よく定量するために使用することができる30。これらの実験を設計する際に考慮すべき重要な技術的制限があります。HeLa細胞を、空のYFPベクター、YFP-パーキンWT、またはYFP-パーキンT240Rでトランスフェクトした。空...

ミトコンドリアネットワークは、エネルギー生産1、自然免疫2,3、および細胞シグナル伝達4,5において重要な役割を果たす一連の相互接続された細胞小器官です。ミトコンドリアの調節不全は、パーキンソン病(PD)などの神経変性疾患と関連しています6,7。PDは、黒質のドーパミン作動性ニューロンに影響を与える進行性の神経変性疾患であり、世界中で約1,000万人が罹患しています8。PDは、損傷したミトコンドリアを選択的に除去する細胞の恒常性を維持するために必要なミトコンドリアの品質管理経路であるマイトファジーと遺伝的に関連しています9,10。研究により、1(FUNDC1)を介したマイトファジーを含むFUN14ドメイン、Bcl-2相互作用タンパク質3(BNIP3)促進マイトファジー、NIX依存性マイトファジー、および十分に特徴付けられたPTEN誘導キナーゼ1(PINK1)/パーキン調節マイトファジー10,11を含む複数の独立したマイトファジー経路が特定されています。PINK1(推定されるキナーゼ)とパーキン(E3ユビキチンリガーゼ)は連携して働き、損傷したミトコンドリアをリン酸ユビキチン化し、損傷した細胞小器官を飲み込み、リソソームと融合して分解を開始するオートファゴソームの形成を促進します12,13,14,15,16。パーキンの変異は、ドーパミン作動性ニューロンの喪失を介した神経変性などのPD結合表現型と関連しています17,18。
ここでは、子宮頸がん由来の不死化細胞であるHeLa細胞を使用して、ミトコンドリアネットワークの健康を維持する上でのパーキンの役割を調査するプロトコルについて説明します。HeLa細胞はごくわずかなレベルの内因性パーキンを発現するため、外因性パーキン発現が必要です19。ミトコンドリアネットワークの健康におけるパーキンの役割を研究するために、HeLa細胞を野生型パーキン(パーキンWT)、パーキン変異体(パーキンT240R)、または空のコントロールベクターのいずれかでトランスフェクトします。パーキンT240Rは、パーキンE3リガーゼ活性に影響を及ぼす常染色体劣性若年性パーキンソニズム変異であり、マイトファジー経路20の効率を著しく低下させる。HeLa細胞は、ミトコンドリア脱共役剤であるカルボニルシアン化物m-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)の軽度(5 μM)または重度(20 μM)濃度にさらされます。高濃度のCCCPによる処理は、HeLaおよびCOS-7細胞などの様々な細胞株においてパーキン媒介マイトファジーを誘導するために日常的に使用されている21、22、23。
治療後、プロトコルは、現在利用可能な2つのミトコンドリア標的蛍光色素を使用したミトコンドリアネットワークのライブイメージングを使用します。テトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸塩(TMRE)は、ミトコンドリア膜電位24に基づいて蛍光を発するカチオン色素であり、MitoSOXは、蛍光強度がスーパーオキシド濃度25の関数であるミトコンドリアスーパーオキシドインジケーターです。最後に、概説したプロトコルは、蛍光ベースの定量とシンプルなワークフローを使用して、ユーザーのバイアスの範囲を最小限に抑えながら、ミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを効果的に定量します。このプロトコルは、HeLa細胞のミトコンドリア機能を研究するために設計されましたが、ミトコンドリアネットワークの健全性を定量的に特徴付けるために、追加の細胞株および初代細胞タイプに適合させることができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, Anhydrous</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGENE 6 (Tranfection Reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX&#160; Red&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Redued Serum media)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental models: Organisms/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-M (Homo sapiens)</td>
			<td>A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EYFP Empty Vector</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP-Parkin T240R</td>
			<td>This Paper</td>
			<td>Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP-Parkin WT</td>
			<td>Addgene; PMID:19029340</td>
			<td>RRID:Addgene_23955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>https://www.adobe.com/products/illustrator</td>
			<td>(Schindelin, 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel (Spreadsheet Software)</td>
			<td>Microsoft Office&#160;</td>
			<td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite (LAS X)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>https://www.microsoft.com/excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism9 (Statistical Analysis Software)</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>https://www.graphpad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage Incubator (Environmental Chamber)</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>https://www.oko-lab.com/cage-incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMiL Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIGHTNING Deconvolution Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STELLARIS 8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based quantification of mitochondrial membrane potential and superoxide levels using live imaging in hela cells

ミトコンドリアは、ATP合成 を介して エネルギー産生を制御することにより、代謝恒常性に不可欠な動的オルガネラです。細胞の代謝をサポートするために、さまざまなミトコンドリアの品質管理メカニズムが連携して、健康なミトコンドリアネットワークを維持します。そのような経路の1つはマイトファジーであり、PTEN誘導キナーゼ1(PINK1)と損傷したミトコンドリアのパーキンホスホユビキチン化は、オートファゴソームの隔離とその後のリソソーム融合 による 細胞からの除去を促進します。マイトファジーは細胞の恒常性にとって重要であり、パーキンの変異はパーキンソン病(PD)に関連しています。これらの発見により、ミトコンドリアの品質管理の分子メカニズムとダイナミクスを理解するために、ミトコンドリアの損傷と代謝回転の研究に大きな重点が置かれてきました。ここでは、生細胞イメージングを使用してHeLa細胞のミトコンドリアネットワークを視覚化し、ミトコンドリア脱共役剤であるカルボニルシアン化m-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)で処理した後のミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを定量化しました。さらに、パーキン依存性マイトファジーを阻害するパーキンのPD結合変異(パーキンT240R)を発現させ、変異発現が野生型パーキンを発現する細胞と比較してミトコンドリアネットワークにどのように影響するかを決定しました。ここで概説するプロトコルは、ミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを効果的に定量するための蛍光ベースのアプローチを使用した簡単なワークフローを説明しています。

The mitochondrial network is a series of interconnected organelles that play a crucial role in energy production1, innate immunity2,3, and cell signalling4,5. Mitochondrial dysregulation has been associated with neurodegenerative diseases such as Parkinson&#39;s disease (PD)6,7. PD is a progressive neurodegenerative disorder affecting dopaminergic neurons of the substantia nigra that impacts nearly 10 million people worldwide8. PD has been genetically linked to mitophagy, a mitochondrial quality control pathway necessary for maintaining cellular homeostasis that selectively removes damaged mitochondria9,10. Studies have identified multiple independent mitophagy pathways, including FUN14 domain containing 1 (FUNDC1)-mediated mitophagy, Bcl-2 interacting protein 3 (BNIP3)-facilitated mitophagy, NIX-dependent mitophagy, and the well-characterized PTEN-induced kinase 1 (PINK1)/Parkin-regulated mitophagy10,11. PINK1 (a putative kinase) and Parkin (an E3 ubiquitin ligase) work in tandem to phospho-ubiquitinate damaged mitochondria, which drives the formation of autophagosomes that engulf the damaged organelle and fuse with lysosomes to initiate degradation12,13,14,15,16. Mutations in Parkin have been associated with PD-linked phenotypes such as neurodegeneration via the loss of dopaminergic neurons17,18.
Here, a protocol is described in which HeLa cells, routinely used immortalized cells derived from cervical cancer, are used to investigate the role of Parkin in maintaining mitochondrial network health. HeLa cells express negligible levels of endogenous Parkin and therefore require exogenous Parkin expression19. To study the role of Parkin in mitochondrial network health, HeLa cells are transfected with either wild-type Parkin (ParkinWT), a Parkin mutant (ParkinT240R), or an empty control vector. ParkinT240R is an autosomal recessive juvenile parkinsonism mutation that affects Parkin E3 ligase activity, significantly reducing the efficiency of the mitophagy pathway20. HeLa cells are subject to mild (5 &#181;M) or severe (20 &#181;M) concentrations of carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), a mitochondrial uncoupling agent. Treatment with severe concentrations of CCCP is routinely used to induce Parkin-mediated mitophagy in various cell lines, such as HeLa and COS-7 cells21,22,23.
Following treatment, the protocol employs live imaging of the mitochondrial network using two currently available mitochondrial-targeted fluorescent dyes. Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate (TMRE) is a cationic dye that fluoresces based on mitochondrial membrane potential24, while MitoSOX is a mitochondrial superoxide indicator where the fluorescence intensity is a function of superoxide concentration25. Finally, the outlined protocol uses a fluorescence-based quantification and simple workflow to effectively quantify the mitochondrial membrane potential and superoxide levels with minimal scope for user bias. Although this protocol was designed to study mitochondrial function in HeLa cells, it can be adapted for additional cell lines and primary cell types to quantitively characterize mitochondrial network health.

著者スポットライト:HeLa細胞のライブイメージングを使用したミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルの蛍光ベースの定量化  

HeLa細胞におけるライブイメージングを用いたミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルの蛍光ベースの定量

This research focuses on mitochondria dysregulation in neurodegenerative diseases. We believe that this research can be used to understand potential causes for disease onset that could lead to therapeutics combating neurodegenerative diseases like Parkinson's disease and ALS. Techniques such as super resolution microscopy like STED and SIM or expansion microscopy have improved the ability to accurately understand protein distribution within individual organelles and mitochondria distribution throughout the cell.Results of this technique can be used as a starting point to study the effect of Parkinson's disease linked mutations on mitochondrial turnover and begin to understand the importance of regulating reactive oxygen species levels and mitochondrial membrane potential to maintain neuronal health. Our laboratory aims to mechanistically characterize individual mitochondrial quality control pathways to understand the interplay between these pathways. By having insights into pathway dynamics, one can understand how mitochondria are maintained and how mitochondrial dysregulation contributes to neurodegenerative disease onset.

このプロトコルでは、蛍光ベースの定量を使用して、CCCP処理後のミトコンドリアネットワークの膜電位とスーパーオキシドレベルを測定しました(図1)。このワークフローでは、子宮頸がん由来の不死化細胞株であるHeLa細胞を使用しました。HeLa細胞は、ミトコンドリア生物学の研究に日常的に使用されており、比較的平坦であるため、顕微鏡を使用してミトコンドリア?...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells at JoVE.com

この手法では、蛍光ベースのライブイメージングを使用して、HeLa細胞内のミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを視覚化し、定量的に測定するための効果的なワークフローについて説明します。

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...

本研究では、神経変性疾患におけるミトコンドリアの調節不全に着目しています。この研究は、パーキンソン病やALSなどの神経変性疾患との闘いの治療法につながる可能性のある疾患発症の潜在的な原因を理解するために使用できると考えています。STEDやSIMなどの超解像顕微鏡や膨張顕微鏡などの技術により、個々の細胞小器官内のタンパク質分布と細胞全体のミトコンドリア分布を正確に理解する能力が向上しました。この手法の結果は、パーキンソン病に関連する突然変異がミトコンドリアの代謝回転に及ぼす影響を研究し、神経細胞の健康を維持するために活性酸素種レベルとミトコンドリア膜電位を調節することの重要性を理解するための出発点として使用できます。私たちの研究室では、個々のミトコンドリアの品質管理経路を機械的に特徴づけ、これらの経路間の相互作用を理解することを目指しています。経路のダイナミクスに関する洞察を得ることで、ミトコンドリアがどのように維持され、ミトコンドリアの調節不全が神経変性疾患の発症にどのように寄与するかを理解することができます。

fluorescence-based-quantification-mitochondrial-membrane-potential

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

3.1K ビュー.  Duke University Medical Center. 本研究では、神経変性疾患におけるミトコンドリアの調節不全に着目しています。この研究は、パーキンソン病やALSなどの神経変性疾患との闘いの治療法につながる可能性のある疾患発症の潜在的な原因を理解するために使用できると考えています。STEDやSIMなどの超解像顕微鏡や膨張顕微鏡などの技術により、個々の細胞小器官内のタンパク質分布と細胞全体のミトコ?...

ビデオ: 著者スポットライト:HeLa細胞のライブイメージングを使用したミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルの蛍光ベースの定量化  

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, various mitochondrial quality control mechanisms cooperate to maintain a healthy mitochondrial network. One such pathway is mitophagy, where PTEN-induced kinase 1 (PINK1) and Parkin phospho-ubiquitination of damaged mitochondria facilitate autophagosome sequestration and subsequent removal from the cell via lysosome fusion. Mitophagy is important for cellular homeostasis, and mutations in Parkin are linked to Parkinson's disease (PD). Due to these findings, there has been a significant emphasis on investigating mitochondrial damage and turnover to understand the molecular mechanisms and dynamics of mitochondrial quality control. Here, live-cell imaging was used to visualize the mitochondrial network of HeLa cells, to quantify the mitochondrial membrane potential and superoxide levels following treatment with carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), a mitochondrial uncoupling agent. In addition, a PD-linked mutation of Parkin (ParkinT240R) that inhibits Parkin-dependent mitophagy was expressed to determine how mutant expression impacts the mitochondrial network compared to cells expressing wild-type Parkin. The protocol outlined here describes a simple workflow using fluorescence-based approaches to quantify mitochondrial membrane potential and superoxide levels effectively.

This technique describes an effective workflow to visualize and quantitatively measure mitochondrial membrane potential and superoxide levels within HeLa cells using fluorescence-based live imaging.

生物学

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging

Begin by mixing 200 microliters of reduced serum media with two micrograms of any one plasmid DNA separately in a sterile micro centrifuge tube one. Repeat this for two other plasmids in separate tubes. Then in the new tube two, mix 200 microliters of reduced serum media with six microliters of transfection reagent and mix the contents by pipetting.Incubate the tubes for five minutes at room temperature before mixing the content of tube two to tube one. In separate tubes, repeat the mixing of the other two plasmids with a transfection reagent. Incubate the mixture for 20 minutes at room temperature.Next, drop-wise, add the transfection complexes to the HeLa cell culture-seeded imaging dishes, ensuring equal distribution across the entire dish. One hour before imaging, open the carbon dioxide tank valve and turn on the environmental controller for the microscope. Using the up and down arrows on the touch pad, adjust the temperature to 37 degrees Celsius and the carbon dioxide to 5%Press Set when complete.To adjust the laser settings, turn on the white light laser by clicking the Acquire tab and selecting Open Laser Overview. In the dialogue box, toggle the white light laser to on. Enter laser power as 85%Click the excitation control button and select maximum power from the dropdown menu.Begin the tetraethyl rhodamine ethyl ester percolate or TMRE, experiment by setting the excitation laser to 514 nanometers and the emission spectra window to 524 to 545 nanometers for YFP. Next, for MitoTracker Deep Red, set the excitation laser to 641 and the emission spectra window to 650 to 750 nanometers. Similarly, for TMRE, set the excitation laser to 555 nanometers and the emission spectra window to 557 to 643 nanometers.Begin the image acquisition setting by selecting the Acquisition tab and adjusting the format to 1024 by 1024. Adjust the speed to 600 in the dropdown menu. Then click the Line Average button and from the dropdown menu, select three.Turn bidirectional scanning on and set the phase and zoom factor to 22.61 and 1.50 respectively. Once done, select the cells based on the YFP fluorescent signal by clicking on the YFP setting one and pressing Fast Live. Then adjust the gain and intensity of YFP and then select cells based on the YFP fluorescent signal.To image the DMSO control plate in the TMRE experiment, adjust the gain and intensity of the TMRE signal setting two so that the mitochondrial network intensity is just below saturation. Keep the gain and intensity for TMRE constant. Then adjust the gain and intensity of the MitoTracker setting one so that the mitochondrial network is visible, but dim.Once the gain and intensity settings are complete, click Start to acquire an image. Acquire images of 20 cells per experimental condition.

共焦点顕微鏡、画像取得セットアップ、および共焦点顕微鏡イメージングのための生物学的サンプル調製

Fluorescence Intensity Quantification of Transfected HeLa Cells Using ImageJ

To measure the fluorescence intensity of the transfected HeLa cells in ImageJ software, click file and select open. In the dialogue box, select the imaging files for the experiment and click okay. Once the bio-formats import options window appears, select split channels and click okay.In tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate, or TMRE experiments, YFP is the first channel, MitoTracker is the second channel and TMRE is the third channel. Adjust the brightness by selecting image, then adjust and then the brightness. Next, load the saved region of interest or ROI by clicking analyze, then tools, then ROI manager.In the ROI manager, click more, then open from the list and select the saved ROI. Then measure the fluorescent intensity of five random regions in a single cell by selecting the saved ROI from the ROI manager and moving the ROI to a random location within a cell. To measure the fluorescence intensity, press M on the keyboard and repeat this with four additional non-overlapping regions.When a dialogue box with the area and mean gray values appears, copy and paste the values into a spreadsheet for analysis. The results for the TMRE and MitoSOX fluorescence intensities showed that their treatment with the known uncoupling agent CCCP decreased the TMRE fluorescence intensity compared to the control conditions. In addition, 20 micromolar CCCP treatment induced superoxide production and increased the MitoSOX fluorescence intensity.In mild or five micromolar CCCP stress conditions, the expression of Parkin wild-type and Parkin T240R resulted in higher TMRE intensity compared to the empty YFP control vector. The MitoSOX intensity was lower in cells expressing Parkin wild-type and Parkin T240R compared to cells expressing the YFP control vector suggesting that Parking expression helps maintain the mitochondrial network health by preserving higher mitochondrial membrane potentials and low superoxide levels.