付着生264.7を含むプレートからメディアを吸引することから始めます。15センチメートルのプレートあたり10ミリリットルのPBSを追加します。セルスクレーパーを使用してセルを取り外し、単一の50ミリリットルのチューブに引き込みます。
細胞懸濁液を上下にピペットでピペットで固定してホモジナイズします。次に、細胞懸濁液容量の5%を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。室温で300Gで5分間遠心分離します。
上清を捨て、全細胞画分ペレットを氷の上に置きます。前述のように残りの懸濁液を遠心分離した後、上清を吸引し、細胞ペレットを5ミリリットルの氷冷ミトコンドリア緩衝液に再懸濁する。懸濁液を300Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。
ペレットを0.5ミリリットルの冷たいミトコンドリア緩衝液に再懸濁する。そして懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。次に、懸濁液を均質化し、1ミリリットルの注射器に取り付けられた25ゲージの針を通して30回バイパスします。
次に、1ミリリットルの冷たいミトコンドリアバッファーをチューブに加え、反転させて混合します。細胞を遠心分離した後、1ミリリットルの上清を氷上の新しいチューブに移します。ペレットをバッファーに再懸濁し、1ミリリットルのシリンジに取り付けられた25ゲージの針を通過させてペレットを均質化します。
ホモジナイズした細胞ペレットと前のステップの上清を1本の1.5ミリリットルのチューブに引き込みます。2, 000Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を収集し、4つの1.5ミリリットルのチューブに分割します。
ミトコンドリアバッファーを使用して、各チューブの容量を1.5ミリリットルにします。チューブを反転させて内容物を混合し、チューブを遠心分離します。上清と上部の白い細胞ペレットを慎重に取り除きます。
茶色のミトコンドリアペレットを含む4本のチューブの1本を粗ミトコンドリア画分として氷上に保管します。残りのペレットを新しいチューブに引き込み、ミトコンドリアバッファーで最終容量を1ミリリットルにします。このプロトコルを用いて、生の264.7マクロファージ細胞株およびBMDMから全細胞および粗ミトコンドリア画分を得た。
免疫血液分析は、ミトコンドリアクエン酸シンターゼが粗画分に富んでいることを示した。細胞質ゾル、原形質膜、核、リソソーム、および小胞体由来のタンパク質は消失した。プロテオーム分析は、粗画分において10倍以上の濃縮を示した。
他の6つの細胞コンパートメントは精製中に枯渇した。
