Superparamagnetic Antibody-Based Mitochondrial Purification

まず、RAW 264.7ミトコンドリアの1ミリリットルの粗画分を15ミリリットルの円錐管に移します。150ミリモルの塩化ナトリウムを添加した7ミリリットルの塩漬けミトコンドリア緩衝液を加える。懸濁液に50マイクロリットルのTOM22ビーズを加えてから、低速で回転するホイール上でチューブをインキュベートします。

カラムを磁石の上に置き、8ミリリットルの塩漬けミトコンドリアバッファーでカラムを平衡化します。フロースルーを破棄します。サンプルインキュベーション後、カラムに移し、フロースルーを廃棄します。

次に、カラムを8ミリリットルの塩漬けミトコンドリア緩衝液で3回洗浄します。磁石からカラムを取り外し、15ミリリットルの円錐管に入れます。ミトコンドリアを溶出するには、1.5ミリリットルの塩漬けミトコンドリアバッファーを加え、すぐにプランジャーを適用して精製画分をチューブに溶出します。

溶出画分を新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、21, 000Gで4°Cで10分間遠心分離を行う。形成された上清を廃棄し、将来の研究のために茶色の純粋なミトコンドリアペレットを摂氏20度で保存します。精製されたミトコンドリア抽出物のイムノブロット分析は、ミトコンドリアクエン酸シンターゼの濃縮および他の細胞小器官からのタンパク質の枯渇を示しました。

電子顕微鏡を用いたミトコンドリアの完全性の研究により、古典的な楕円形と電子密度の高い抗体コーティングビーズに囲まれた無傷のクリステを持つミトコンドリアが明らかになりました。さらに、プロテオーム分析は、ミトコンドリアタンパク質の濃縮と、ミトコンドリアタンパク質と非ミトコンドリアタンパク質に対応する2つの異なる集団を示しました。