まず、顕微鏡、光源、カメラ、吸引システムの電源を入れます。灌流システムの洗浄には、第1チャンバーにリンゲル溶液を使用し、第2チャンバーにピリチオンを添加したリンゲル亜鉛溶液を使用します。蛇口を閉じた後、チャンバーに同じ溶液を入れます。
サンプル調製を開始するには、溝の狭い側を上にして灌流チャンバーを置き、溝の周りにシーリングシリコンを塗布します。次に、細いピンセットを使用して、セルを下に向けて溝の上に洗浄液から13ミリメートルのカバーガラスを移します。13mmのカバーガラスの上に22mmのカバーガラスを置き、カバーガラスにひびが入らないように注意しながらピンセットで締めます。
チャンバーをひっくり返して押し、液体を放出します。次に、溝に100マイクロリットルのリンガーの洗浄液を入れ、漏れないように再度押します。灌流チャンバーをプラットフォームに取り付けて固定します。
次に、灌流用の灌流チューブと吸引チューブを溝の細胞に取り付けます。灌流速度を毎分約2ミリリットルに変更し、リンガーの溶液灌流をオンにします。測定するには、イメージングソフトウェアを開きます。
顕微鏡の左側のボタンを使用して、顕微鏡の倍率を10倍に設定します。ライブビューを選択した後、ジョイスティックを使用してプラットフォームを動かし、溝のセルに焦点を合わせます。mCherryに適切な波長を選択します。
細胞に焦点を合わせたら、プラットフォームを移動して適切な細胞パッチを選択します。[ROI の描画] ドロップダウン メニューを選択します。[Draw Circular ROIs] を選択し、mCherry 発現細胞を含む細胞クラスター上に ROI を描画します。
Shift ボタンを押したまま、既存の ROI を長押ししてドラッグすることで、最初の ROI を超えて新しい ROI を作成します。ドロップダウン メニューから [Draw Square Background ROI] を選択し、セルが存在しない背景 ROI の位置とサイズを調整します。バックグラウンドROIに細胞がないことを確認したら、ND取得タブに移動します。
[波長]サブタブを選択し、そのチェックボックスをオンにします。GFP波長のチェックボックスもオンになっていることを確認します。[時間] サブタブをクリックし、測定間隔を 5 秒ごと、期間を 30 分ごとに定義します。
顕微鏡パネルで、オンを押してパーフェクトフォーカスシステム(PFS)を有効にします。[ND Acquisition] で [PFS on] にチェックが入っていることを確認します。フォーカスを調整し、[今すぐ実行] をクリックします。
リンガーの溶液灌流を使用して90秒間のベースライン期間測定を開始します。90秒後、リンガー溶液灌流からリンゲル亜鉛溶液灌流に切り替え、蛍光上昇が飽和し始めたら、メインインターフェースパネルの右下にある赤いフラグをクリックします。実験時間が終了するまで、リンガーの溶液による灌流に戻します。
ベースライン減算でデータをエクスポートするには、バックグラウンド補正ボタンを押して、ND取得ウィンドウで変更を確認します。[エクスポート]ボタンをクリックして、データを目的の場所に保存します。蛍光の増加は細胞内亜鉛濃度の上昇に起因し、減少は細胞膜を横切って亜鉛を輸送するZnT-1の活性を示しました。
野生型のZnT-1は、亜鉛負荷に対する細胞応答のばらつきに関連して、変異体よりも滑らかな蛍光曲線を示しました。野生型とデルタ型のUSCTDの活性を比較した箱ひげ図では、平均輸送速度が類似しており、野生型と変異型の間に差がないことが示された。ただし、スプレッドの違いは機能的な違いを示している可能性があります。
