クラス2の層流フードの下で作業しながら、マウスから採取した血管周囲脂肪組織またはPVATを2回順次洗浄することから始めます。まず、10%ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するPBSを用い、次に、1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したPBSを用いる。すすぎさせた組織を滅菌済みの60ミリメートルペトリ皿に移し、200マイクロリットルの消化液を加えます。
滅菌ハサミを使用して、組織を1立方ミリメートルの寸法の小片に細かく刻みます。滅菌ハサミの助けを借りて、プラスチック製のピペットチップを切って端を広げます。次に、ミンチにした組織ミックスを、幅広のピペットチップを使用して15ミリリットルの遠心チューブに移します。
6ミリリットルの消化液を組織に加え、消化を開始します。チューブをラックに水平に結んだ後、オービタルシェーカーで摂氏37度で30〜45分間インキュベートします。5〜10分ごとに、インキュベーターのシェーカーからチューブを取り外し、手動で激しく上下に振ってください。
消化した組織ミックスを70ミクロンのセルストレーナーに通し、50ミリリットルの遠心チューブに通します。ストレーナーを等量の培地ですすぎ、細胞収量を最大化し、消化を急冷します。濾液を新しい15ミリリットルの遠心チューブに移します。
チューブを遠心分離して、間質血管画分またはSVFを分離します。チューブを裏返して上清を廃棄し、ペレットを5ミリリットルのPBSに再懸濁します。上清を廃棄する前に、チューブを1, 800 Gで5分間再度遠心分離します。
ペレットを適切な量の培地に再懸濁します。細胞をコラーゲンでコーティングした12ウェルプレートに播種し、5%の二酸化炭素を含む湿度の高い雰囲気で摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、培地を吸引し、37°Cにあらかじめ温めた抗生物質を添加したPBSで細胞を洗浄して、細胞の破片と赤血球を除去します。
最後に、各ウェルに1ミリリットルの新鮮な培地を加え、細胞が所望のコンフルエント段階に達するまで培養を続けます。
