フォトチューナブルハイドロゲルコンストラクトの3Dプリンティングを開始するには、線維芽細胞を含むハイドロゲルバイオインクが入ったガラスシリンジをプリントヘッド内に配置し、プリント用のしっかりとした組み立てを確保しながらプリントヘッドコンポーネントを取り付けます。次に、Pronterfaceソフトウェアの方向矢印を使用して、ウェルプレートのウェルの中央にあるサポートバススラリー内の押出針の位置を手動かつ慎重に調整します。針先の下に少なくとも1ミリメートルのスラリーを残します。
針先が正しく配置されたら、Pronterfaceソフトウェアの印刷ボタンを押して、印刷が完了するのを待ちます。必要な数のバイオプリントコンストラクトが得られるまで、前述の手順を繰り返します。プリント後、コンストラクトを室温で覆ったウェルプレートをバイオセーフティキャビネットに1時間放置します。
これにより、塩基触媒による重合を光可変ハイドロゲルバイオインクで行うことができます。次に、3Dバイオプリントされたコンストラクトを含むウェルプレートを摂氏37度の滅菌インキュベーターに12〜18時間置き、サポートバススラリーを溶かします。次に、バイオセーフティキャビネット内で、バイオプリントされたコンストラクトを囲むメディアを交換します。
これを行うには、構築物を乱すことなく、培地と溶融したゼラチンサポートバスをウェルから手動で除去します。次に、各ウェルに適切な量の低血清培地を添加します。ここでも、所望の硬化時点の24時間前に、ウェル内の培地を、2.2ミリモルの滅菌LAPを添加した低血清培地と交換します。
希望の硬化時点で、硬化するウェルから培地の半分を取り除き、蓋なしでプレートをOmniCureの紫外線またはUV光の下に置きます。365ナノメートルのバンドパスフィルターでUVライトを点灯し、コンストラクトを5分間硬化させます。硬化したら、これらのウェルから残りの培地を取り除き、各ウェルに新しい低血清培地を追加します。
プレートをインキュベーターに戻して、所望の時点で線維芽細胞活性化試験を行い、酸性バイオインクと塩基性支持浴スラリーの組み合わせにより、3Dバイオプリントコンストラクトの重合が促進され、円筒構造が維持されました。蛍光標識されたハイドロゲルの顕微鏡検査では、支持体浴中のゼラチン微粒子によって誘導されるヒドロゲル内の細孔が示されました。共焦点顕微鏡では、3Dで空間制御が過度に硬化していることが示されました。
線維芽細胞生存率アッセイでは、肉厚が300ミクロンのコンストラクトと、1ミリリットルあたり400万個の細胞を有するコンストラクトが、すべての時点で他のすべての条件よりも優れていることが明らかになりました。生存率は7日目にピークに達し、細胞の約91%が生きたまま染色され、14日目までに85%がまだ生存していました。
