脱細胞化リンゴ由来足場におけるアルカリホスファターゼ活性、カルシウム沈着、ヤング率測定

アルカリホスファターゼアッセイおよびカルシウム沈着アッセイでは、まず、適切な培地で培養した細胞播種したリンゴ由来の足場をPBSで3回洗浄します。足場を10%中性緩衝ホルマリンで30分間固定します。アルカリホスファターゼアッセイでは、BCIP/NBT錠剤1錠を10ミリリットルの脱イオン水に溶解してBCIP/NBT染色溶液を調製します。

次に、固定足場を0.05%TWEEN溶液で洗浄し、BCIP/NBT溶液で室温で20分間染色します。染色スキャフォールドを0.05%TWEEN溶液で洗浄し、PBSで保存します。次に、12メガピクセルのデジタルカメラで汚れた足場を画像化します。

カルシウム沈着アッセイでは、2重量%のAlizarin Red S染色溶液を調製します。次に、固定された足場を脱イオン水で洗浄し、Alizarin Red S溶液で室温で1時間染色します。染色した足場を脱イオン水で洗浄し、イメージング前にPBSに保管します。

12メガピクセルのデジタルカメラで撮影した画像。ヤング率測定を行うには、細胞播種したスキャフォールドをそれぞれのインキュベーション培地から取り出し、1.5ニュートンのロードセルを備えた特注の一軸圧縮装置を使用してサンプルを直ちに試験します。足場を毎分3ミリメートルの一定速度で、足場の高さの10%の最大圧縮ひずみまで圧縮します。

応力/ひずみ曲線の線形部分の傾きからヤング率を求めます。BCIP/NBT染色により、分化培地で培養した細胞播種スキャフォールドでは、ブランクまたは非分化培地培養細胞播種スキャフォールドと比較して、アルカリホスファターゼ活性が大幅に増加することが明らかになりました。Alizarin Red S染色でも同様の結果が得られ、分化培地で培養した細胞播種足場のカルシウム石灰化が大きいことが示されました。

分化培地で培養した細胞播種足場のヤング率は約192.0キロパスカルであり、ブランクまたは非分化培地培養細胞播種足場よりも有意に高く、剛性が高いことが示された。