脱細胞化リンゴ由来スキャフォールドの調製と細胞播種

まず、マンドリンスライサーを使用して、マッキントッシュのリンゴを8ミリの厚さのスライスに切ります。リンゴのスライスのヒパンチウム組織を5×5ミリメートルの正方形に切ります。正方形のサンプルを0.1%SDSに2日間入れて脱細胞化します。

インキュベーション後、サンプルを脱イオン水で洗浄し、100ミリモルの塩化カルシウム中で室温で一晩インキュベートします。次に、これらの足場を70%エタノールで30分間滅菌します。それらを脱イオン水で洗浄し、24ウェル培養プレートに入れます。

細胞播種には、MC3T3-E1サブクローン4細胞を直径10cmの細胞培養処理皿に保持し、細胞培養条件で使用します。また、10%ウシ胎児血清またはFBSおよびストレプトマイシン中の1%ペニシリンを添加したαMEMからなる細胞培養培地を調製します。細胞のコンフルエント度が80%に達したら、トリプシン処理により細胞を培養皿から分離します。

細胞懸濁液を200gで3分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞をαMEMに再懸濁します。次に、足場の表面に細胞懸濁液の40マイクロリットルアリコートをピペットで移し、細胞培養条件で1時間接着させる。

続いて、各培養ウェルに2ミリリットルの培地を添加する。2〜3日ごとに培地を14日間補充します。14日後、細胞培養培地に1ミリリットルあたり50マイクログラムのアスコルビン酸と4ミリモルのリン酸ナトリウムを添加して分化培地を調製します。

この培地を培養プレートに加えます。MC3T3-E1細胞の分化を誘導するためにスキャフォールドを4週間インキュベートし、3〜4日ごとに培地を補充します。