灌流セットをメーカーのプロトコルに従ってユニットに取り付けます。フードの内側に空の流体チップを取り付け、サイトカインを添加したSFM-34培地を添加して、無菌条件下で両方のリザーバーを満たします。流路ユニットをインキュベーターに移し、ポンプに接続して気泡の除去と校正を行います。
セットが接続された流路ユニットをインキュベーターから慎重に取り外し、細胞を含むチップと一緒にフードに移します。テストチップの両側にチューブをクランプします。クランプされたチューブをテストチップから取り外し、セルを含むチップをチューブに接続します。
クランプを取り外すか開いた後、システムをインキュベーターに移し、エアポンプを流体ユニットに接続します。流体ユニットをポンプから取り外し、フードに移動させます。チップの両側のチューブをクランプし、チップのリザーバーからチューブを取り外します。
チップから培地を静かに取り除いた後、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で細胞を洗浄します。150マイクロリットルの解離バッファーを加え、摂氏37度で3分間インキュベートします。細胞が剥離したら、1つのリザーバーから解離バッファーを回収し、DPBSでチャネルを1回洗浄します。
リザーバーを洗浄バッファーで洗浄し、チップから残りの細胞を回収します。最後に、採取した細胞に1ミリリットルの洗浄バッファーを加えてから、そこから10マイクロリットルを使用して細胞をカウントします。刺激前はランダムな向きを示していましたが、刺激を受けると流れの方向と平行に向きを変えました。
フロー下で5日間培養した細胞のCD34発現プロファイルと、流路から回収したCD34陽性細胞の割合から、プロトコルの有効性が示されました。
