まず、頑丈なはさみまたははさみを使用して、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブの円錐形の底から0.5ミリメートルのキャップの端を切り取ります。カットしたチューブにグラスウールを入れて、中央の穴を覆います。組み立てたグラスウールフィルターユニット1つを滅菌済みの1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れ、チューブにラベルを付けます。
次に、スカートなしの96ウェルPCRプレートを6つの2列サポートラックに切断します。ウェルの円錐形の底が上を向くように、2列のラックを裏返します。湿らせた濾紙を入れたガラスのシャーレにラックを置き、蓋をして葉鞘用の湿度チャンバーを作ります。
胞子を採取するColletotrichum graminicolaから分生子を採取するには、3〜4ミリリットルの滅菌脱イオン水をプレートに加えます。滅菌した円錐形の先端の乳棒を使用して、プレート全体を均等にこすり、寒天から胞子をほぐします。1ミリリットルの胞子懸濁液をグラスウールフィルターユニットに無菌的に添加し、胞子が重力によって収集チューブに流れ込むようにします。
ろ過した胞子懸濁液を3, 500Gで5分間遠心分離し、液体をオートクレーブ可能な容器に注ぎます。1ミリリットルの滅菌脱イオン水を収集チューブに加え、静かに攪拌してペレット化した胞子を再懸濁します。ここでも、懸濁液を遠心分離し、胞子を再懸濁して300〜500マイクロリットルの脱イオン水に定量します。
100倍の倍率の複合顕微鏡下で血球計算盤を使用して、胞子濃度を決定します。次に、脱イオン水でミリリットル懸濁液あたり500、000個の胞子を準備します。第2段階の苗の最初の本葉から鞘を取り除きます。
シースの重なり合う縁に沿ってサムネイルを走らせ、シュートからそっと緩めます。回収した葉鞘を3〜5センチメートルのセグメントにカットします。各セグメントを慎重に広げて、内側の表皮層を露出させます。
20マイクロリットルの真菌胞子懸濁液を、中央肋骨の上のシースの中央にある内面に塗布します。接種した葉鞘を水平に置き、中央の肋骨を底に置き、湿らせた濾紙を入れたガラスのペトリプレートに入れます。次に、湿らせた発芽紙で裏打ちされた透明な収納ボックスに小さな湿度チャンバーを入れ、収納ボックスを蓋で覆い、摂氏23度で連続照明の下で目的の時間経過でインキュベートします。
鞘に病気の兆候がないか定期的にチェックしてください。
