著者らは、USDA-NIFAの財政支援に感謝する(助成金番号2018-67013-28489および2020-70410-32901)。この原稿で表明された意見、調査結果、結論、または推奨事項は、著者のものであり、必ずしも米国農務省の見解を反映しているわけではありません。ブラジルからの「国境なき科学」の客員学生であるMayara de Silva氏には、図 6A と 図7Dの画像を提供していただいたことに感謝します。また、ケンタッキー大学の植物病理学部がオリンパスの共焦点顕微鏡へのアクセスを提供してくれたことにも感謝します。

注: このメソッドのワークフローを 図 1 に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig01.jpg"> 図1:剥離したトウモロコシの葉鞘を使用した最適化された接種プロトコルのステップ。 胞子懸濁液の調製、葉鞘の接種、生細胞顕微鏡用のサンプル調製は、それぞれ緑色(A)、紫色(B)、オレンジ色(C)のボックスで強調表示されています。BioRender.com で作成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
1.植物および菌類材料
<ol><li>植物の成長<ol><li>温室(14時間明るい/ 27°Cおよび10時間暗い/ 22°C)でSC10容器(材料表を参照)でトウモロコシの苗木(材料表を参照)を栽培します。市販の鉢植え用土3部(材料表を参照)と蒸気滅菌した表土2部からなる成長培地を使用します。</li>
		<li>毎日1回、朝に頭上灌漑システムで2分間苗に水をやります。</li>
		<li>V2段階で苗木を土壌レベルで刈り取り、収穫します。V2成長段階は、苗木の高さが5〜10 cmで、2つの目に見える襟付きの葉があるときに到達します21。</li>
		<li>湿らせたペーパータオルで植物を包み、ビニール袋に入れて実験室に運び、さらに処理します。</li>
	</ol></li>
	<li>菌類培養<ol><li>適切な寒天培地に約50粒の感染シリカを振りかけることにより、無菌条件下で保存された真菌シリカストック培養物を再活性化する22。形態学的変化および病原性の喪失を避けるために、継代培養は再活性化後に3倍以下に菌株を添加する。ジャガイモデキストロース寒天培地(PDA;材料 表参照)は C.グラミニコラ の培養に日常的に使用され、オートミール寒天培地(OA; 材料表参照)は S.maydisに使用されます。</li>
		<li>真菌ストックを培養するためのPDAを調製するには、市販の脱水PDA19.5gを500mLの脱イオン(DI)水に懸濁します。OAを作るには、市販の脱水OA36gを脱イオン水で15〜30分間煮沸し、3層のチーズクロスでろ過し、脱イオン水で500mLの濾液にします。滅菌するオートクレーブ媒体。</li>
		<li>形質転換株を扱う場合は、溶融して冷却した培地に適切な抗生物質(ハイグロマイシンB、遺伝剤など)を添加します。培地500 mL中のハイグロマイシンまたはゲネチシンの最終濃度は、それぞれ250 μg/mLおよび100 μg/mLです。</li>
		<li>胞子状の菌糸体が発達するまで、最適な条件下で培養物をインキュベートします。 Colletotrichum graminicola と S. maydis は、蛍光灯と周囲湿度レベルが連続する 23 °C でよく育ちます。胞子形成は、 S. maydis では接種後 7 日(dai)、 C. graminicola では 14 dai までに発生します。</li>
	</ol></li>
</ol>2.葉鞘接種
<ol><li>グラスウールフィルターユニットアセンブリ<ol><li>頑丈なハサミまたははさみを使用して、キャップと1.5 mL微量遠心チューブの円錐形の底から約0.5 mmを切り取ります( 材料表を参照)。</li>
		<li>グラスウール(約0.5 cm x 0.5 cm、 材料表を参照)をカットチューブの内側に置き、 図2に示すように中央の穴を覆います。</li>
		<li>ホウールガラスは刺激を引き起こす可能性があるため、グラスウールを切断するときは手袋を着用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>リーフシースサポートラックの準備<ol><li>図3Aに示すように、スカートのない96ウェルPCRプレート(材料表を参照)を6つの2列(8 x 2ウェル)サポートラックに切断します。</li>
		<li>ウェルの円錐形の底が上を向き、平らな上部が下を向くように、2列ラックを裏返します(図3B)。</li>
		<li>湿らせた濾紙を入れたガラスペトリプレートに各支持体を置き、蓋で覆います( 材料表を参照)。このユニットは、シース用の小さな湿度チャンバーとして機能します。</li>
	</ol></li>
	<li>接種剤の調製<ol><li>各真菌株について、 図2に示すように、組み立てたグラスウールフィルターユニット1つを無傷の滅菌済み1.5 mL微量遠心チューブに入れます。後者は収集チューブとして機能します。</li>
		<li>チューブにラベルを付けます。</li>
		<li>胞子培養物から分生子を採取するには、まず各プレートに3〜4 mLの滅菌脱イオン水を浸します。場合によっては、コロニー表面に液体の層を生成するために、より多くの水が必要になることがあります。このシステムでは湿潤剤は必要ありません。</li>
		<li>滅菌された円錐形の先端の乳棒( 材料表を参照)を使用して寒天から胞子をほぐし、プレート全体を均等にこすります。</li>
		<li>胞子懸濁液1mLをグラスウールフィルターユニットに無菌的に塗布し、胞子が重力によって収集チューブに流れるようにします。</li>
		<li>ろ過した胞子懸濁液を含むコレクションチューブを 3,500 x g で 5 分間遠心分離します。胞子は、微量遠心チューブの底にペレット化する必要があります。 注:ここで推奨されている速度よりも速い速度で C.graminicola 胞子を遠心分離すると、生存率が大幅に失われます。</li>
		<li>液体をオートクレーブ可能な容器に注ぎ、1 mLの滅菌脱イオン水を加え、穏やかに攪拌してペレット状の胞子を再懸濁します。ステップ2.3.6のように遠心分離します。</li>
		<li>胞子を3回洗浄して、発芽や浸透を低下させる可能性のある自己阻害剤を含む可能性のある分生子マトリックスを取り除きます。</li>
		<li>3回目の洗浄後、300〜500μLの滅菌DI水を加えて、胞子を再懸濁して定量します。</li>
		<li>100倍の倍率の複合顕微鏡下で血球計算盤を使用して、胞子濃度を決定します。カウントする前に胞子染色は必要ありません。</li>
		<li>5 x 105 胞子/mL懸濁液を滅菌脱イオン水で調製します。 注: C.グラミニコラ 胞子懸濁液は、生存率が急速に失われる前に、室温で4時間以内に保つことができます。.分生子を冷蔵しても生存率は向上しません。</li>
	</ol></li>
	<li>シース接種<ol><li>植物に真菌株を接種する前に、関連するバイオセーフティの慣行と手順を確認してください。</li>
		<li>鞘の重なり合う縁に沿って親指の爪を走らせて、V2苗の最初の本葉から鞘を取り除き、シュートからそっと緩めます。シュートを取り外す前に、シュートの両側からシースを緩めます。</li>
		<li>回収した葉鞘を3〜5cmのセグメントに切ります。接種前にシースの表面消毒を行う必要はありません。</li>
		<li>各セグメントを非常にゆっくりと広げて、内側(同軸)表皮層を露出させます。</li>
		<li>接種用のシースを準備している間、乾燥を防ぐために、残りの切除シースを湿らせたペーパータオルで包んでおいてください。</li>
		<li>真菌胞子懸濁液20 μLを、 図4に示すように、シース片の中央、中肋骨の真上の内面に置きます。</li>
		<li>図5に示すように、接種した葉鞘を水平に置き、中肋骨を下にして、湿らせた濾紙を含むガラスペトリプレート内の支持体に入れます。</li>
		<li>各ラックには最大7つのシースを収納できます。サンプル調製またはインキュベーション中に発生する可能性のある反復の損失を補うために、株ごとに少なくとも5つのシースを接種します。</li>
		<li>小さな湿度チャンバーを、湿らせた発芽紙で裏打ちされた透明な収納ボックスに入れます( 材料表を参照)。</li>
		<li>箱を蓋で覆います。ボックスを23°Cでインキュベートし、意図した時間経過の間、観察される真菌の発生段階に応じて連続的に照射します。 C. graminicola を接種したトウモロコシ鞘の経時変化の概要を 表1に示す。</li>
		<li>鞘に病気の兆候や症状がないか毎日チェックし、発芽とろ紙の両方を湿らせておきます。葉鞘は、接種がない場合に明らかな植物細胞の死滅や分解なしに、最大6日間保持することができます。</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig02.jpg"> 図2:グラスウールフィルターユニットの準備。(A) 0.5cm×0.5cmのグラスウールボールを、円錐形の底を取り除いた微量遠心チューブ1の内側に入れます。 (B-C) 次いで、濾過管を微量遠心管2に入れて、胞子懸濁液調製用の組み立て済みフィルターユニットを生成する。BioRender.com で作成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig03.jpg"> 図3:スカートなしの96ウェルPCRプレートの切断方法。(A) PCRプレートを6つのサポートラック、8 x 2ウェルにカット。単一のシース支持体の例を (B )に示します。葉鞘は支持体に水平に置かれます。BioRender.com で作成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig04.jpg"> 図4:鞘の接種方法。 シース部のアキシャル面に直接塗布された接種液のシングルドロップ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig05.jpg"> 図5:シースインキュベーション法。 接種した葉鞘を、湿らせた濾紙が入ったガラスペトリプレート内の支持ラックに水平に置いた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
3. 生細胞顕微鏡
<ol><li>顕微鏡用サンプル調製<ol><li>シース片を滅菌DI水でやさしくすすぎ、付着していない胞子や表面的な真菌の増殖を取り除きます。</li>
		<li>シースピースのアキシャル(内側)面を下向きにし、アキシャル(外側)面を一番上にして、シースを清潔なガラス顕微鏡スライド( 材料表を参照)に置きます。</li>
		<li>新しい片刃のカミソリの刃( 材料表を参照)を使用して、シースの端を約1cm切り取り、中肋の両側の層組織のほとんどを取り除きます。</li>
		<li>かみそりの刃をシースに対して90°の角度で保持して、軸方向の中肋骨から組織を剃り、接種スポットの上の軸面に表皮層を露出させます。均一な厚さを維持するようにしてください。葉鞘を削った後は、サンプルを損傷する可能性があるため、それ以上のトリミングはお勧めしません。</li>
		<li>剃った部分のサイズが1cm×1cm以下であることを確認してください。このプロセス中は、シースの中心を押さないでください。異なる胞子懸濁液を接種したシースを扱う場合は、手袋を消毒し、サンプル間でカミソリの刃を交換してください。</li>
		<li>清潔なガラス顕微鏡スライドを用意しておいてください。シースセクションを片方の端から持ち上げ、慎重に新しいスライドに移します。シースの接種された(同軸)表面は、対物レンズに最も近い最上部にある必要があります。真菌構造への損傷を避けるために、セクションを静かに取り付けます。</li>
		<li>切片に60 μLの滅菌脱イオン水を塗布し、24 mm x 60 mmのガラスカバーガラスを追加します( 材料表を参照)。気泡を避けるために、これをゆっくりと行ってください。</li>
		<li>顕微鏡検査の準備ができたら、カバーガラスを透明なマニキュアで密封し( 材料表を参照)、各端に小さな滴を置き、滴をマニキュアブラシで接続してシームレスシールします。 注:このシースプロトコルは、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)、ニュートラルレッド、トリパンブルーなどの細胞学的染色剤、または植物細胞の生存率を評価するための細胞質分解の観察に使用できます。シース染色または細胞形質分解アッセイでは、カバーガラスを密封しないでください。</li>
		<li>プラズマ分解アッセイでは、高張溶液(0.75 Mスクロースまたは1 M塩化ナトリウム)をカバーガラスの一方の端に加え、折りたたんだ糸くずの出ないティッシュペーパーを使用して、サンプルを横切ってカバーガラスのもう一方の端まで溶液を引き寄せます。染色には、同様の方法で染色液を塗布します。</li>
	</ol></li>
	<li>広視野顕微鏡<ol><li>葉鞘を顕微鏡スライドに取り付けたら、400倍の倍率の広視野光学顕微鏡を使用して真菌のコロニー形成を検査します。</li>
		<li>真菌の構造を詳細に観察するには、サンプルの画質を向上させるために、油ではなく水浸対物レンズを使用します。屈折率のミスマッチによる球面収差は、画像劣化の原因となります。水対物レンズは、広視野光学顕微鏡と共焦点顕微鏡に使用できます。</li>
		<li>シースあたりのコロニー形成の相対量を決定するには、100倍の倍率の広視野光学顕微鏡を使用して、各真菌浸透部位から侵入したトウモロコシ細胞の数をカウントします。この定量化は、菌株、治療法、および/または発生段階を比較する統計分析の前に適切なスクリーニングステップです。</li>
	</ol></li>
	<li>共焦点レーザー走査型顕微鏡<ol><li>トランスジェニック真菌株の発生中にトウモロコシ組織中の蛍光タンパク質を観察するには、基本的な画像取得パラメーターを調整します。選択した蛍光マーカーに基づいて最適な励起/発光設定を特定します。 注:分泌タンパク質で構築された蛍光融合体を分析する場合は、60倍の水対物レンズが望ましいです。最新の共焦点顕微鏡は、アーチファクトや形状収差を避けるために、高度に補正された水浸対物レンズを備えています。</li>
		<li>蛍光タンパク質の生細胞イメージングを意図する場合は、自家蛍光のコントロールとして形質転換されていない真菌株を使用します。以下の画像取得パラメータを使用して、倒立共焦点顕微鏡およびmCherry蛍光タンパク質で真菌-宿主のダイナミクスをキャプチャします。レーザー出力を最大5%、発現レベルに応じて450〜600の高電圧(HV)、1.375 Xゲイン、3%オフセット、セクションあたり最大5つのトウモロコシ細胞の分析用の光学ズームファクター1、個々の菌糸の光学ズームファクターを2〜5に設定します。 注:高解像度のZスタック共焦点画像は、3次元データを提供し、宿主と病原体の間のリアルタイムの相互作用をよりよく表示します。</li>
		<li>分泌融合タンパク質に対応する蛍光強度の定量には、共焦点メーカーの画像解析ソフトウェアや、オンラインで無料でダウンロードできるImageJなどの画像処理プログラムを使用します。それに応じて蛍光シグナルを定量する方法の詳細については、マニュアルを参照してください。</li>
	</ol></li>
</ol>

トウモロコシ鞘と菌類の細胞間相互作用の可視化

<ol>
	<li>Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+and+molecular+analysis+of+nonhost+resistance+in+rice+to+wheat+powdery+mildew+and+leaf+rust+pathogens.">Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens.</a> Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).</li><li>Hickey, E. L., Coffey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fine-structural+study+of+the+pea+downy+mildew+fungus+Peronospora+pisi+in+its+host+Pisum+sativum.">A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum.</a> Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).</li><li>Wharton, P. S., Julian, A. M., O'Connell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+the+infection+of+Sorghum+bicolor+by+Colletotrichum+sublineolum.">Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum.</a> Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).</li><li>Latunde-Dada, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+process+and+identity+of+the+hemibiotrophic+anthracnose+fungus+(Colletotrichum+destructivum+O'Gara)+from+cowpea+(Vigna+unguiculata+(L)+Walp.).">Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O'Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.).</a> Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).</li><li>Bourett, T. M., Howard, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+penetration+structures+in+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+grisea.">In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea.</a> Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).</li><li>Sakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+new+method+of+sheath+inoculation+of+rice+plants+with+blast+fungus,+Pyricularia+oryzae+Cav.,+for+the+studying+of+the+disease-resistant+nature+of+the+plant.">On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant.</a> Bulletin of the Institute for Agricultural Research, T&#333;hoku University. 1 (3), 120-129 (1949).</li><li>Buiate, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+genomic+analysis+of+putative+pathogenicity+genes+in+the+host-specific+sibling+species+Colletotrichum+graminicola+and+Colletotrichum+sublineola.">A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola.</a> BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).</li><li>Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+rice+membrane+dynamics+and+plasmodesmata+during+biotrophic+invasion+by+the+blast+fungus.">Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus.</a> The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).</li><li>Khang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+Magnaporthe+oryzae+effectors+into+rice+cells+and+their+subsequent+cell-to-cell+movement.">Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement.</a> The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).</li><li>Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+transcriptome+analysis+identifies+Magnaporthe+oryzae+BAS1-4+as+biotrophy-associated+secreted+proteins+in+rice+blast+disease.">Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease.</a> The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).</li><li>Sakulkoo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+fungal+MAP+kinase+controls+plant+cell-to-cell+invasion+by+the+rice+blast+fungus.">A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus.</a> Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).</li><li>Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+diffusible+factor+that+induces+susceptibility+in+the+Colletotrichum-maize+disease+interaction.">Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction.</a> Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).</li><li>Valent, B., Khang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+rice+blast+effector+research.">Recent advances in rice blast effector research.</a> Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).</li><li>Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+characterization+of+infection+and+colonization+of+maize+leaves+by+Colletotrichum+graminicola,+and+by+a+C.+graminicola+pathogenicity+mutant.">Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant.</a> Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).</li><li>Vargas, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+defense+mechanisms+are+activated+during+biotrophic+and+necrotrophic+development+of+Colletotricum+graminicola+in+maize.">Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).</li><li>Venard, C., Vaillancourt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+fiber+cells+by+Colletotrichum+graminicola+in+wounded+maize+stalks.">Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks.</a> Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).</li><li>Venard, C., Vaillancourt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+and+colonization+of+unwounded+maize+tissues+by+the+maize+anthracnose+pathogen+Colletotrichum+graminicola+and+the+related+nonpathogen+C.">Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C.</a> sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).</li><li>Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+influence+of+inoculation+methods+on+in+planta+growth+of+rice+blast+fungus.">Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus.</a> Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).</li><li>Belis&#225;rio, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+anthracnose+stalk+rot+in+the+genomic+era.">Maize anthracnose stalk rot in the genomic era.</a> Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).</li><li>Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+Colletotrichum+graminicola+on+sweet+corn+in+Indiana.">Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana.</a> Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).</li><li>Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+a+corn+plant+develops.">How a corn plant develops.</a> Special Report, Iowa State University. 48, (1986).</li><li>Tuite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant pathological methods: fungi and bacteria. , (1969).</li><li>Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+metabolites+from+Stenocarpella+maydis,+a+stalk+and+ear+rot+pathogen+of+maize.">Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize.</a> Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).</li><li>Daudi, A., O'Brien, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+hydrogen+peroxide+by+DAB+staining+in+Arabidopsis+leaves.">Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves.</a> Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).</li><li>Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+tracking+of+the+endoplasmic+reticulum+in+live+pathogenic+fungal+cells.">Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).</li><li>Lorang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+is+lighting+up+fungal+biology.">fluorescent protein is lighting up fungal biology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).</li><li>Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+yeast+organelles+with+fluorescent+protein+markers.">Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).</li><li>Westermann, B., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-targeted+green+fluorescent+proteins:+convenient+tools+for+the+study+of+organelle+biogenesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).</li><li>Lee, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER+chaperone+and+signaling+regulator+GRP78/BiP+as+a+monitor+of+endoplasmic+reticulum+stress.">The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress.</a> Methods. 35 (4), 373-381 (2005).</li><li>Krishnakumar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+maize+database+resource+that+captures+tissue-specific+and+subcellular-localized+gene+expression,+via+fluorescent+tags+and+confocal+imaging+(Maize+Cell+Genomics+Database).">A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database).</a> Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).</li><li>Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+marker+lines+in+maize:+generation+and+applications.">Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications.</a> International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).</li><li>O'Connell, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifestyle+transitions+in+plant+pathogenic+Colletotrichum+fungi+deciphered+by+genome+and+transcriptome+analyses.">Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses.</a> Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).</li><li>Torres, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Colletotrichum+graminicola+mutant+deficient+in+the+establishment+of+biotrophy+reveals+early+transcriptional+events+in+the+maize+anthracnose+disease+interaction.">A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction.</a> BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).</li><li>Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ToxA+and+ToxB+promoter-driven+fluorescent+protein+expression+vectors+for+use+in+filamentous+ascomycetes.">Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes.</a> Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).</li><li>Gordon, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucoamylase::+green+fluorescent+protein+fusions+to+monitor+protein+secretion+in+Aspergillus+niger.">Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger.</a> Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).</li><li>Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inoculation+method+of+Magnaporthe+grisea+for+cytological+observation+of+the+infection+process+using+intact+leaf+sheaths+of+rice+plants.">A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).</li><li>Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggressiveness+of+Colletotrichum+sublineola+strains+from+Sorghum+bicolor+and+S.+halepense+to+sweet+sorghum+variety+Sugar+Drip,+and+their+impact+on+yield.">Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield.</a> Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).</li></ol>

著者らは、競合する金銭的利害関係はなく、開示するものも何もないと宣言しています。

ここで説明する最適化された葉鞘接種法は、イネの葉鞘のために開発され、適用されている元のプロトコルから変更されています6,8,36。これにより、広視野顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、生きた植物細胞における真菌の成長と発生を直接かつ詳細に観察することができます。プロトコルはトウモロコシのコロニー...

細胞レベルでの空間的および時間的分析は、真菌と植物の相互作用の生理学と細胞学を理解するために重要です。過去には、化学的に固定された葉面組織1,2,3または透明化して染色した4、および人工膜5が、葉面病原体の発生と植物と真菌の相互作用の細胞診を調べるために使用されてきました。しかし、固定や透明化を行わずに、生きた宿主組織の感染事象をリアルタイムで調べることは、イメージング用の光学的に透明なサンプルの調製に関連する技術的な問題があるため、困難です。
1940年代後半に、イネいもち病菌Magnaporthe oryza6に対する生きたイネ表皮細胞の耐性を明視野顕微鏡で調べるために、分離葉鞘接種プロトコルが開発されました。最近では、ColletotrichumおよびMagnaporthe種による宿主コロニー形成の詳細な分子学的、生理学的、および細胞学的観察は、この葉鞘法の修正バージョンと、蛍光タンパク質を発現する真菌形質転換体、および落射蛍光および共焦点顕微鏡検査を含む高性能生細胞イメージングプロトコルを組み合わせることによって非常に容易になりました7,8,9,10、11、12、13。
この論文では、半栄養性および壊死栄養性の葉状真菌病原体による感染過程を観察するために、剥離したトウモロコシ葉鞘を使用した最適化された接種プロトコルについて詳しく説明します。具体的には、炭疽病の葉枯れ病や茎腐病の原因菌であるColletotrichum graminicola(C. graminicola)や、ディプロディアの葉枯れ病や茎腐病の原因となるStenocarpella maydisの研究に使用しています。ただし、この方法は、他の半栄養性および壊死栄養性の葉面真菌病原体にも適用できるはずです。これらの切除された葉鞘における感染およびコロニー形成イベント中の細胞学的および生理学的応答は、葉身全体の反応と同様である12,14,15。さらに、C. graminicolaによる鞘表皮細胞の半栄養性コロニー形成は、茎髄細胞のコロニー形成に類似している16,17。剥離した鞘は、葉身や茎の髄組織よりも、真菌の浸透とコロニー形成の同期性と実験的再現性が高いことを示しています14,16,17,18。ほとんどのトウモロコシ品種は、このプロトコルに使用できます。ただし、鞘に過剰な紫色の色素を持つ近交系またはハイブリッドは、色素がイメージングを妨げるため、あまり適していません。ゴールデンジュビリースイートコーンは、未処理の種子が市販されており、植物は多くの葉の病気に非常にかかりやすく、温室でよく育つため、私たちの研究に特に役立ちました。1970年代に米国で炭疽病の茎腐れ病が最初に流行した結果、インディアナ州ではスイートコーンの収穫が完全に失われました19,20。この葉鞘接種法は、生きた植物細胞と局所的に殺された植物細胞の真菌の成長と発生を直接観察および定量化し、真菌感染に対する適合/非互換応答における耐性反応を実証し、同じ鞘上の真菌株間の相互作用をリアルタイムでテストするために適用できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axiocam monochrome microscope camera</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>426560-9010-000</td>
			<td>Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioplan 2 epifluorescence microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Allows live viewing and image/video capture&#160;of biological samples&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002431</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon bacteriological Petri dish with lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-105</td>
			<td>Polystyrene material; hydrophobic surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-920-115</td>
			<td>Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV 3000 laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For visualization of fungal transformants&#39;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germination paper</td>
			<td>Anchor Paper Co.</td>
			<td>SD7615L</td>
			<td>76# heavy weight for plastic box moist chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dishes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>75845-542</td>
			<td>Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; 
			complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool&#160;</td>
			<td>Ohio Valley Specialty Chemical&#160;</td>
			<td>3350</td>
			<td>For glass-wool filter units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>15170-172</td>
			<td>0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-553-457&#160;</td>
			<td>Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize cultivar Golden Jubilee seeds</td>
			<td>West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada</td>
			<td>CN361</td>
			<td>Matures&#160;in 95-105 days; seed type: F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td>USA Scientific&#160;&#160;</td>
			<td>1415-2500</td>
			<td>1.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-123&#160;</td>
			<td>Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal Agar (OA)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>255210</td>
			<td>Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>43671</td>
			<td>Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-skirted 96-well PCR plate</td>
			<td>USA Sientific</td>
			<td>1402-9500</td>
			<td>100 uL plate volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle for microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific&#160;</td>
			<td>1415-5390</td>
			<td>Conical tip; polypropylene material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-UB933</td>
			<td>Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>90000-758</td>
			<td>Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Mix BX</td>
			<td>Premium Horticulture Supply Co.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Premium general-purpose growing medium formulated to provide 
			a&#160;balance of water retention and proper drainage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC10 cone-tainers&#160;</td>
			<td>Greenhouse Megastore&#160;</td>
			<td>CN-SS-SC-10B</td>
			<td>1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC10 cone-tainers tray</td>
			<td>Greenhouse Megastore&#160;</td>
			<td>CN-SS-SCTR98</td>
			<td>24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge razor blade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-989-145</td>
			<td>AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage containers/boxes with latch closure</td>
			<td>Target</td>
			<td>002-02-0405</td>
			<td>Clear view storage boxes for rmoist chamber; 
			outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detached maize sheaths for live-cell imaging of infection by fungal foliar maize pathogens

トウモロコシの葉鞘に半栄養性および壊死栄養性の葉面病原性真菌を接種するためのプロトコルを最適化しました。この方法は、もともとイネの葉鞘に適用されていた方法から変更され、生きた植物細胞の真菌の成長と発生を直接顕微鏡で観察することができます。トウモロコシの苗から採取した葉鞘に、2つの葉の襟が完全に出現し、20 μLの滴下(5 x 105 胞子/mLの真菌胞子懸濁液)を接種し、23°Cの湿度チャンバー内で連続蛍光灯下でインキュベートします。24〜72時間後、余分な組織をカミソリの刃で除去し、表皮細胞の単層、化学的固定や透明化を必要とせずに直接画像化できる光学的に透明なサンプルを残します。植物細胞と真菌細胞は実験期間中生き続け、相互作用をリアルタイムで視覚化できます。シースを染色または形質分解して、感染およびコロニー形成中の宿主細胞および病原体細胞の発生細胞診および生存率を研究することができます。蛍光タンパク質を発現するように形質転換された真菌株を鞘に接種または同時接種することで、分解能を高め、競合的または相乗的相互作用の評価を容易にすることができます。蛍光融合タンパク質を発現する真菌株を使用して、 プランタにおけるこれらの個々のタンパク質の産生および標的化を追跡および定量化することができます。接種した鞘組織を抽出して、核酸、タンパク質、または代謝物を特徴付けることができます。これらのシースアッセイの使用は、トウモロコシの真菌病原性のメカニズム、および病原性に寄与する真菌タンパク質エフェクターおよび二次代謝産物の詳細な研究を大幅に前進させました。

Spatial and temporal analyses at the cellular level are critical for understanding the physiology and cytology of fungal-plant interactions. Foliar tissues that have been chemically fixed1,2,3or cleared and stained4, as well as artificial membranes5, have been used in the past to investigate the cytology of foliar pathogen development and plant-fungal interactions. However, investigation of infection events in living host tissues in real-time without fixation or clearing is challenging due to technical issues related to the preparation of optically transparent samples for imaging.
A detached leaf sheath inoculation protocol was developed in the late 1940s for bright field microscopic investigation of resistance of living rice epidermal cells to the rice blast fungus Magnaporthe oryza6. More recently, detailed molecular, physiological, and cytological observations of host colonization by Colletotrichum and Magnaporthe species have been greatly facilitated by combining modified versions of this leaf sheath method with fungal transformants expressing fluorescent proteins, and high-performance live-cell imaging protocols, including epifluorescence and confocal microscopy7,8,9,10,11,12,13.
This paper details an optimized inoculation protocol using detached maize leaf sheaths for observation of infection processes by hemibiotrophic and necrotrophic foliar fungal pathogens. We have specifically used it to study Colletotrichum graminicola (C. graminicola), the causal agent of anthracnose leaf blight and stalk rot, and Stenocarpella maydis, which causes Diplodia leaf blight and stalk rot. However, the method should be applicable to other hemibiotrophic and necrotrophic foliar fungal pathogens. Cytological and physiological responses during infection and colonization events in these excised leaf sheaths are similar to those in entire leaf blades12,14,15. Furthermore, hemibiotrophic colonization of sheath epidermal cells by C. graminicola is similar to colonization of stalk pith cells16,17. Detached sheaths show greater synchronicity and experimental reproducibility of fungal penetration and colonization than leaf blades or stalk pith tissues14,16,17,18. Most maize varieties can be used for this protocol. However, inbreds or hybrids with excessive purple pigments in the sheaths are less suitable since the pigments interfere with imaging. Golden Jubilee sweet corn has been particularly useful for our studies because untreated seeds are commercially available, the plants are highly susceptible to many foliar diseases, and they grow well in the greenhouse. The first epidemics of anthracnose stalk rot in the United States resulted in the total loss of sweet corn crops in Indiana in the 1970s19,20. This leaf sheath inoculation method can be applied to directly observe and quantify fungal growth and development in living vs. locally killed plant cells, to demonstrate resistance reactions in compatible/incompatible responses to fungal infection, and to test interactions between fungal strains on the same sheath in real-time.

著者スポットライト:トウモロコシにおける真菌の病原性メカニズムの調査 

真菌葉トウモロコシ病原体による感染の生細胞イメージングのための分離トウモロコシ鞘

So our team aims to understand fungal pathogenicity mechanisms in plants to improve disease management. We are currently exploring how the maize autochthonous fungus regulates protein secretion beyond its housekeeping function. Our protocol shows high synchronicity across replications and reproducibility of fungal colonization.Also, with our assays, there is no need for clearing or fixating samples before imaging them in real-time. The method offers a variety of applications in plant-pathogen interactions and contributed to detailed studies on the mechanisms of fungal pathogenicity in maize and comparative genomic analysis.

以下の例は、トウモロコシ葉鞘接種法を使用した後の代表的な結果を示しています。これらの例は、トウモロコシと真菌の相互作用の観察と比較を、この最適化されたアッセイでリアルタイムに行うことの容易さ、速度、精度を示しています。また、生細胞イメージングは定量的な情報の抽出を可能にし、分子学的、細胞学的、生理学的の比較研究に有用なツールを提供します。詳細につい?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Fungal Pathogenicity Mechanisms in Maize at JoVE.com

この原稿では、トウモロコシと真菌植物病原体との相互作用の再現性のある細胞学的、生理学的、および分子学的研究のために、剥離したトウモロコシの葉鞘を使用する最適化された接種プロトコルについて詳しく説明します。葉鞘は、未固定組織における生きた植物と真菌の間の細胞相互作用のリアルタイム観察を容易にします。

We have optimized a protocol to inoculate maize leaf sheaths with hemibiotrophic and necrotrophic foliar pathogenic fungi. The method is modified from one ...

そこで私たちの研究チームは、植物の真菌病原性メカニズムを理解し、病害管理を改善することを目指しています。私たちは現在、トウモロコシの自生菌がハウスキーピング機能を超えてタンパク質の分泌をどのように制御するかを研究しています。私たちのプロトコルは、真菌のコロニー形成の複製と再現性全体で高い同期性を示しています。また、当社のアッセイでは、サンプルを透明化したり固定したりしてから、リアルタイムでイメージングする必要がありません。この方法は、植物と病原体の相互作用にさまざまな用途を提供し、トウモロコシの真菌病原性のメカニズムに関する詳細な研究と比較ゲノム解析に貢献しました。

detached-maize-sheaths-for-live-cell-imaging-infection-fungal-foliar

Research

JoVE Journal

Biology

Detached Maize Sheaths for Live-Cell Imaging of Infection by Fungal Foliar Maize Pathogens

1.0K ビュー.  University of Kentucky. そこで私たちの研究チームは、植物の真菌病原性メカニズムを理解し、病害管理を改善することを目指しています。私たちは現在、トウモロコシの自生菌がハウスキーピング機能を超えてタンパク質の分泌をどのように制御するかを研究しています。私たちのプロトコルは、真菌のコロニー形成の複製と再現性全体で高い同期性を示しています。また、当社のアッ?...

ビデオ: 著者スポットライト:トウモロコシにおける真菌の病原性メカニズムの調査 

We have optimized a protocol to inoculate maize leaf sheaths with hemibiotrophic and necrotrophic foliar pathogenic fungi. The method is modified from one originally applied to rice leaf sheaths and allows direct microscopic observation of fungal growth and development in living plant cells. Leaf sheaths collected from maize seedlings with two fully emerged leaf collars are inoculated with 20 &#181;L drops of 5 x 105 spores/mL fungal spore suspensions and incubated in humidity chambers at 23 &#176;C under continuous fluorescent light. After 24-72 h, excess tissue is removed with a razor blade to leave a single layer of epidermal cells, an optically clear sample that can be imaged directly without the necessity for chemical fixation or clearing. Plant and fungal cells remain alive for the duration of the experiment and interactions can be visualized in real-time. Sheaths can be stained or subjected to plasmolysis to study the developmental cytology and viability of host and pathogen cells during infection and colonization. Fungal strains transformed to express fluorescent proteins can be inoculated or co-inoculated on the sheaths for increased resolution and to facilitate the evaluation of competitive or synergistic interactions. Fungal strains expressing fluorescent fusion proteins can be used to track and quantify the production and targeting of these individual proteins in planta. Inoculated sheath tissues can be extracted to characterize nucleic acids, proteins, or metabolites. The use of these sheath assays has greatly advanced the detailed studies of the mechanisms of fungal pathogenicity in maize and also of fungal protein effectors and secondary metabolites contributing to pathogenicity.

This manuscript details an optimized inoculation protocol that uses detached maize leaf sheaths for reproducible cytological, physiological, and molecular studies of maize interactions with fungal plant pathogens. The leaf sheaths facilitate real-time observation of cellular interactions between the living plant and fungus in unfixed tissues.

生物学

Inoculation of Maize Leaf Sheaths with Pathogenic Fungi for Assessing Fungal Pathogenicity

To begin, use heavy duty scissors or shears to cut off the cap end 0.5 millimeters from the conical bottom of a 1.5-milliliter micro-centrifuge tube. Place a piece of glass wool in the cut tube to cover the center hole. Place one assembled glass wool filter unit into a sterile 1.5-milliliter micro-centrifuge tube and label the tube.Next, cut a non-skirted 96-well PCR plate into six two-column support racks. Flip the two-column racks so the conical bottoms of the wells face upwards. Place the rack in a glass Petri dish containing moist filter paper and cover it with the lid to create a humidity chamber for the leaf sheaths.To harvest conidia from the sporulating Colletotrichum graminicola, add three to four milliliters of sterile deionized water into the plate. Using a sterile conical tip pestle, scrape evenly across the entire plate to loosen the spores from the agar. Aseptically add one milliliter of spore suspension onto a glass wool filter unit and allow the spores to flow into the collection tube by gravity.Centrifuge the filtered spore suspension at 3, 500 G for five minutes and pour off the liquid into an autoclavable container. Add one milliliter of sterile deionized water into the collection tube and gently agitate to resuspend the pelleted spores. Again, centrifuge the suspension and resuspend the spores for quantification in 300 to 500 microliters of deionized water.Use a hemocytometer under a compound microscope at 100 times magnification to determine the spore concentration. Then prepare 500, 000 spores per milliliter suspension with deionized water. To remove the sheath from the first true leaf of week two stage seedlings.Run a thumbnail along the overlapping margin of the sheath and gently loosen it from the chute. Cut the recovered leaf sheath into three to five-centimeter segments. Carefully unroll each segment to expose the inner epidermal layer.Apply 20 microliters of fungal spore suspension on the inner surface at the center of the sheath above the mid-rib. Place the inoculated leaf sheaths horizontally, with a mid-rib positioned at the bottom, in a glass Petri plate containing moistened filter paper. Next place the small humidity chambers into a clear storage box lined with moistened germination paper, cover the storage box with a lid, and incubate at 23 degrees Celsius under continuous illumination for the intended time course.Regularly check the boxes for signs of disease on the sheaths.

真菌病原性評価のためのトウモロコシ葉鞘の病原性真菌の接種

Preparation of Fungal Infected Detached Maize Leaf Sheaths for Live-Cell Imaging

To begin, gently rinse the maize leaf sheaths inoculated with fungal spores in deionized water. Place the sheath on a clean glass microscope slide with the adaxial surface facing down and the abaxial surface uppermost. Using a single-edge razor blade, trim approximately one centimeter off the sheath ends and remove most lamina tissue on either side of the midrib.Hold the razor blade at a 90-degree angle to shave tissue from the abaxial midrib, exposing the epidermal layer on the adaxial surface above the inoculated spot. Carefully lift the sheath section from one edge and transfer it onto a new slide with the adaxial surface facing the uppermost closest to the objective lens. Apply 60 microliters of deionized water to the section and place a glass cover slip without introducing air bubbles.Stenocarpella maydis rapidly invaded epidermal cells directly via undifferentiated hyphal swellings. While Colletotrichum graminicola produced melanized appressoria. Trypan blue staining revealed the nature and extent of fungal hyphae colonization, with C.graminicola initially invading via thick primary hyphae and later switching to a necrotrophic stage.C.graminicola invades living maize cells using thick primary hyphae separated from the host cytoplasm by a membrane. In contrast, S.maydis produces a phytotoxin that kills the epidermal cells before invading them. In C.graminicola, the production of dark brown precipitate in the maize leaf sheaths indicated an oxidative burst related to a host-resistance response.