まず、安楽死させたマウスに75%アルコールをスプレーします。次に、解剖ハサミを滅菌して皮膚を開き、胸腔を露出させました。横隔膜を切開し、下顎に向かって上向きに切開を続け、頸動脈を露出させている余分な結合組織や脂肪を慎重に取り除きます。
次に、下大静脈を切開して、閉じた循環から血流を出させます。注射器を使用して、20ミリリットルの予冷灌流溶液を左心室にゆっくりと注入します。マウスを実体顕微鏡の下に置きます。
次に、マイクロ解剖ハサミを使用して、頸動脈の周りの脂肪と結合組織をはがします。頸動脈を分離し、PBSで洗浄して残留血液を洗い流します。氷上で1.5%FBSを含む6ウェルプレートに動脈を移します。
マイクロ解剖ハサミを使用して、頸動脈を縦方向に解剖し、氷上に1ミリリットルのFBSが入った新しい6ウェルプレートに平らに置きます。動脈の内膜をFBSで慎重に洗い流し、残留血液を取り除きます。動脈を2ミリメートル四方の組織片に切断し、1.5ミリリットルの遠心チューブに移します。
400G、摂氏4度で5分間遠心分離し、組織を底に沈めます。上清を廃棄し、組織を500マイクロリットルの解離試薬に再懸濁します A.チューブを摂氏37度のウォーターバスに1時間入れ、10分ごとに1ミリリットルのピペットで静かにピペッティングします。次に、500マイクロリットルの5%FBSをチューブに加え、よく混ぜます。
細胞懸濁液を滅菌した40ミクロンのセルストレーナーで1.5ミリリットルのチューブにろ過します。次に、濾液を遠心分離し、上清を除去してから、ペレットを200マイクロリットルの解離試薬に再懸濁します B.チューブをウォーターバスに入れて、細胞を単一細胞懸濁液に完全に解離させます。5分後、200マイクロリットルの5%FBSを添加して消化反応を終了させ、懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄してから、ペレットを100マイクロリットルのPBSに氷上に再懸濁します。
顕微鏡観察では、解離試薬Bと試薬Aを組み合わせると、解離試薬Aのみを使用した場合と比較して、頸動脈組織の解離がより完全に行われることが示されました。合計176, 000個の単一細胞が9つの左頸動脈から収集され、ほとんどの血管血管は生存率の高い単一細胞に正常に解離されました。消化後、教師なしSIRAHベースのクラスタリングにより、正常なマウス頸動脈に4つの主要な細胞タイプがあることが明らかになりました。
