この研究は、中国自然科学基金会(82070450 to C.T.および82170466 to L.Z.)およびChina Postdoctoral Science Foundation(7121102223 to F.L.)のフェローシップからの助成金によって支援されました。

以下に説明するすべての動物手順は、東呉大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。
1. 試薬・材料調製
<ol><li>カルシウムとマグネシウムを含まない1x PBSと2.5 U/mLのヘパリンナトリウム塩を利用して、灌流溶液を調製します。4°Cで保存し、使用するときは氷上で予冷してください。</li>
	<li>1250 CDU/mL のコラゲナーゼ II と 3000 U/mL の DNase I を HBSS で希釈することにより、125 CDU/mL のコラゲナーゼ II と 60 U/mL の DNase I を含む解離試薬 A を調製します。使用するまで4°Cで保管してください。</li>
	<li>1 mLの0.25%EDTAフリートリプシン(フェノールレッドなし)を1 mLの1x PBSに希釈して、最終濃度0.12%トリプシンを含む解離試薬Bを調製します。使用するまで4°Cで保管してください。</li>
	<li>1x PBSで10 mLの1.5% FBSと10 mLの5% FBSを調製します。1.5%FBSを使用して頸動脈をプールし、使用前に氷上に保管してください。5%FBSを使用して消化を中和し、室温(RT)で保存します。</li>
	<li>1 mL シリンジ、26 G 針付き 20 mL シリンジ、6 ウェル細胞培養プレート、1.5 mL 遠心チューブ、40 μm 滅菌細胞ストレーナー、氷容器などの実験材料を入手してください。</li>
</ol>2. 機器の準備
<ol><li>実体顕微鏡、解剖ハサミ、マイクロ解剖ハサミ、先端細い鉗子など、すべての手術器具を滅菌します。</li>
	<li>自動セルカウンターをオンにし、RTに維持します。</li>
	<li>あらかじめ37°Cまで水浴をONにしてください。</li>
	<li>使用前に微量遠心分離機を4°Cに予冷してください。</li>
</ol>3. マウス頸動脈の単離
<ol><li>腹腔内注射で1.25%トリブロモエタノール(体重10 gごとに0.24 mL)を使用してマウスを麻酔し、マウスを裏返して3分後に正動反射があるかどうかを確認します。.次に、子宮頸部脱臼によりマウスを安楽死させ、仰向けに寝かせます。マウスの皮膚に75%アルコールをスプレーします。</li>
	<li>滅菌された解剖ハサミを使用して皮膚を開き、胸腔を露出させます。ダイヤフラムを切り開きます。</li>
	<li>下顎まで上向きに切断を続け、余分な結合組織と脂肪を慎重に取り除き、頸動脈を露出させます。</li>
	<li>マウスの下大静脈を切開して、閉じた循環から血流を作ります。</li>
	<li>20 mLの予冷灌流溶液をシリンジで左心室にゆっくりと連続的に注入します。 注:灌流が成功すると、肝臓、脾臓、腎臓などの血液が豊富な臓器が灰白色に変わります。</li>
	<li>頸動脈周辺の脂肪組織や結合組織を実体顕微鏡下でマイクロ解剖ハサミで剥がします。 注意: この手順は、頸動脈の損傷を防ぐために、ゆっくりと慎重に行う必要があります。</li>
	<li>マウスから頸動脈を単離し、1x PBSで洗浄して血液を再度洗い流し、氷上で1.5%FBSを含む6ウェルプレートに移します。</li>
</ol>4. 頸動脈の単一細胞懸濁液への消化
<ol><li>マイクロ解剖ハサミを使用して頸動脈を縦方向に解剖し、氷上に1.5%FBS1 mLを含む別の6ウェル細胞培養プレートに平らに置きます。</li>
	<li>内膜を1.5%FBSで注意深く洗い流して、残留血液を取り除きます。 注:フラッシングは、内皮細胞を傷つけないように、穏やかでゆっくりと行う必要があります。</li>
	<li>1.5%FBSのマイクロダイセクションハサミを使用して、各頸動脈を約2mm2 の組織片に切断します。</li>
	<li>これらの組織片を、1 mLのボアチップが付いた1.5 mLの遠心チューブに移し、400 x g で4°Cで5分間遠心分離し、組織を底に沈めます。</li>
	<li>上清を廃棄し、組織を500μLの解離試薬Aに再懸濁します。</li>
	<li>チューブを37°Cのウォーターバスに1時間入れます。10分ごとに1 mLのピペットで静かにピペットします。</li>
	<li>500 μL の 5% FBS をチューブに加え、1 mL のピペットでよく混ぜます。</li>
	<li>細胞懸濁液を40 μmの滅菌セルストレーナーでろ過し、新しい1.5 mL遠心チューブに入れ、400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を慎重に除去し、細胞ペレットを200 μLの解離試薬Bに再懸濁します。</li>
	<li>37°Cのウォーターバスに入れ、さらに5分間消化します。消化中は2分ごとに静かにピペットで移し、完全に解離して単一細胞懸濁液にします。</li>
	<li>200 μL の 5% FBS を使用して消化反応を終了し、400 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を廃棄し、細胞ペレットを100 μLの1x PBSに氷上に再懸濁します。</li>
</ol>5. 細胞懸濁試験とシングルセルRNAシーケンシング
<ol><li>10 μLのシングルセル懸濁液に10 μLのAO/PI溶液を加え、20 μLのピペットで穏やかに混合します。</li>
	<li>混合物20μLをチャンバースライドにピペットで移し、1分間待ちます。</li>
	<li>スライドを自動セルカウンター装置にロードします。</li>
	<li>AO/PI Viability assay を選択し、品質レポートを待ちます。</li>
	<li>シングルセル 3 インチ試薬キットを使用して、シングルセルコントローラー上のエマルジョン中にシングルセルゲルビーズを生成し、メーカーのプロトコルに従ってサーマルサイクラーでバーコード化された cDNA を増幅します。 注:ここでは、Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3を使用しました。</li>
	<li>ペアエンド 150 bp (PE150) 読み取りストラテジーを使用してシーケンサーでシーケンシングを実行します。ソフトウェアアプリケーション(Cell Ranger)を使用して、 mkfastq パイプラインを使用して生のベースコールファイルをfastqファイルに変換します。次に、Cell Ranger のカウント パイプラインを使用して、アライメント、フィルタリング、バーコード カウント、および一意の分子識別子 (UMI) カウント を実行し、特徴バーコード マトリックスを生成します13。</li>
	<li>R パッケージ Seurat14 を使用して、データの次元削減と視覚化を実行します。<ol><li>まず、Seurat の Read10X() 関数が Cell Ranger パイプラインの出力を読み取り、カウント行列を使用して Seurat オブジェクトを作成します。次に、<200または>4000の遺伝子の発現、またはミトコンドリア遺伝子比が10%を超える細胞をSeuratの subset() 関数でフィルタリングします。</li>
		<li>NormalizeData() と FindVariableFeatures() を使用してデータを正規化し、それぞれ 2000 個の変動の大きい特徴を識別します。</li>
		<li>スケーリングされたデータに対して主成分分析 (PCA) を実行し、dims = 30、resolution = 0.5 でセルをクラスター化します。最後に、 RunUMAP () 関数を使用して単一セルのデータセットを可視化し、 FindAllMarkers() を使用して各クラスター バイオマーカーを見つけます。</li>
	</ol></li>
</ol>

マウス頸動脈の2段階細胞消化

<ol>
	<li>Lee, D. -. Y., Chiu, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+and+flow:+roles+of+epigenetic+modulation+in+vascular+endothelium.">Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium.</a> Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56 (2019).</li><li>Libby, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56 (2019).</li><li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+applications:+A+brief+overview.">Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview.</a> Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694 (2022).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Rohlenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+maps+endothelial+metabolic+plasticity+in+pathological+angiogenesis.">Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).</li><li>Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+gained+from+single-cell+analysis+of+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment.">Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment.</a> Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).</li><li>Sun, H., Xu, X., Deng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single+epithelial+cells+suspension+from+mouse+mammary+glands.">Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands.</a> Bio-Protocol. 10 (4), e3530 (2020).</li><li>Korin, B., Chung, J. -. J., Avraham, S., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+of+mouse+glomeruli+for+high-throughput+analysis.">Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis.</a> Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).</li><li>Thomson, B., Quaggin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+single+cell+suspension+from+the+murine+iridocorneal+angle.">Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle.</a> Bio-Protocol. 12 (10), e4426 (2022).</li><li>Leale, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-stage+digestion+of+whole+murine+knee+joints+for+single-cell+RNA+sequencing.">A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321 (2022).</li><li>Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+aorta.">Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta.</a> Bio-Protocol. 6 (11), e1832 (2016).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+dissociator.">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. 29, e1266 (2009).</li><li>You, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+UMI-based+single-cell+RNA-seq+preprocessing+workflows.">Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows.</a> Genome Biology. 22 (1), 339 (2021).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Depuydt, M. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanatomy+of+the+human+atherosclerotic+plaque+by+single-cell+transcriptomics.">Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics.</a> Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).</li><li>Gao, X. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+of+the+rat+carotid+arteries+uncovers+potential+cellular+targets+of+neointimal+hyperplasia.">Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152 (2021).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+the+lumen+of+mouse+carotid+arteries+for+single-cell+multi-omics+experiments.">Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. 176, e63128 (2021).</li></ol>

著者には開示すべき利益相反はありません。

ここでは、野生型マウスの頸動脈から高品質の単一細胞懸濁液を調製するための詳細なプロトコルを提供し、コラゲナーゼ/DNaseとトリプシンの消化プロセスを統合した2段階の消化法を構築しました。シングルセル懸濁液の品質チェックの結果、細胞の生存率が85%を超え、細胞濃度が高いため、シングルセルシーケンシングの要件を満たしていることがわかりました。さらに、頸動脈のVSMC、?...

アテローム性動脈硬化症は、高血圧、高脂血症、血行動態などの危険因子に関連する慢性炎症性疾患です1。頸動脈分岐部は血行動態の変化を起こしやすく、頸動脈プラークの形成につながります。頸動脈アテローム性動脈硬化症の臨床症状は、脳卒中や一過性脳虚血などの急性の場合もあれば、再発性一過性脳虚血や血管性認知症などの慢性の場合もある2。機械的には、頸動脈プラークは、病理学的条件下での異なる血管壁細胞と様々な血液細胞との間の相互作用の結果である。したがって、生理学的および病理学的条件下で頸動脈血管の単一細胞アトラスを明らかにすることは、頸動脈プラークの発生を予防および治療するために特に重要です。
シングルセルRNAシーケンシングは、超高分解能で同じ細胞型の生物由来の細胞の不均一性を検出できるため、生物学研究において最も強力な技術の1つです3,4。研究者は、心血管疾患5やがん6など、多くの分野で研究を行うためにシングルセルRNAシーケンシングを使用してきました。しかし、組織を迅速かつ正確に単一細胞に分離することは、依然として主要な課題の1つです。酵素解離は、コラゲナーゼ、パパイン、トリプシン、DNase、ヒアルロニダーゼを主に含む一般的に使用される方法です。具体的には、コラゲナーゼは単一細胞消化の主要な酵素種であり、主に結合組織のコラーゲン成分を加水分解します。乳腺7、糸球体8、虹彩角膜角9、膝関節10、大動脈11、肺12など、異なる種類のコラゲナーゼが異なる組織の解離に適用可能である。異なる組織の特異な生理学的特性により、同じ方法で解離すると、細胞生存率の低下、細胞数の減少、細胞破片の多大化など、単一細胞の獲得に多くの問題が発生する可能性があります。したがって、異なる組織に対する消化法の発明は、高品質の単一細胞懸濁液を調製するために不可欠です。
このプロトコルは野生型マウスの頸動脈の単一セル懸濁液を準備するために二段階のセル消化力方法を開発することを向ける。コラゲナーゼは頸動脈組織のコラーゲンを加水分解し、さらにトリプシンで消化して単細胞懸濁液となるため、頸動脈の特性に応じて、コラゲナーゼ/DNaseとトリプシンを組み合わせ、マウス頸動脈の高品質な単細胞懸濁液を得ました。アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム(AO/PI)の二重蛍光計数を使用して細胞の生存率と濃度を検出したところ、単一細胞懸濁液は、細胞の生存率が85%を超え、細胞濃度が高いため、単一細胞シーケンシングの要件を満たしていることがわかりました。シングルセルデータ解析の結果、消化後の正常なマウス頸動脈において、血管平滑筋細胞(VSMC)、線維芽細胞、内皮細胞(EC)、マクロファージおよび樹状細胞(Mφ/DC)の4種類の細胞が同定されました。このプロトコルの利点は、1)頸動脈の複数の細胞タイプを識別でき、2)細胞生存率がよく維持され、3)特別な機器なしで簡単に繰り返すことができます。このプロトコルは、マウス頸動脈の単一細胞マルチオミクスの研究に関心のある研究者に適しています。このプロトコルは、適切な修正を施すことで他の血管を解離させることにも役立つ可能性があります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% EDTA-free trypsin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0205</td>
			<td>Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl saline solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST341</td>
			<td>Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>&#160;SKJYLEAN</td>
			<td>sk-r009</td>
			<td>To perform cardiac perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2211W</td>
			<td>To centrifuge the tissue piece and cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>SKJYLEAN</td>
			<td>sk-r013</td>
			<td>To perform cardiac perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>css010040</td>
			<td>To filter undigested tissue fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI kit</td>
			<td>Hengrui Biological</td>
			<td>RE010212</td>
			<td>To identify whether the cell is alive or dead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>Mira FL</td>
			<td>To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger software</td>
			<td>10&#215; Genomics</td>
			<td>3.0.2</td>
			<td>To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39;Reagent Kits v3</td>
			<td>10&#215; Genomics</td>
			<td>1000075</td>
			<td>To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td>Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td>Termination of the digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Store at the room temperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>H8060</td>
			<td>Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002560</td>
			<td>Applied for spining down the tissues and cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequencer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1000</td>
			<td>Used for cardiac perfusion and resuspension of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat package- R</td>
			<td>Satija Lab</td>
			<td>3.1.2</td>
			<td>To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well cell culture plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>703002</td>
			<td>Place the vascular tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S22</td>
			<td>Keep the digestion temperature at 37 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a single-cell suspension from mouse carotid arteries for single-cell sequencing

頸動脈は、脳に血液と酸素を供給する首の主要な血管ですが、頸動脈がプラークで詰まると頸動脈狭窄症が起こります。頸動脈の細胞組成を単一細胞レベルで明らかにすることは、頸動脈アテローム性動脈硬化症の治療に不可欠です。しかし、頸動脈からの単一細胞懸濁液を調製するためのすぐに使用できるプロトコルはありません。細胞へのダメージを抑えながら、単一細胞レベルで正常な頸動脈を解離させるのに適したプロトコルを得るために、コラゲナーゼ/DNaseとトリプシンの消化プロセスを統合することにより、2段階の消化法を設計しました。アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム(AO/PI)の二重蛍光計数を使用して細胞の生存率と濃度を検出したところ、単一細胞懸濁液は、細胞の生存率が85%を超え、細胞濃度が高いため、単一細胞シーケンシングの要件を満たしていることがわかりました。単一細胞のデータ処理後、各頸動脈細胞で細胞あたり中央値~2500の転写産物が検出されました。特に、血管平滑筋細胞(VSMC)、線維芽細胞、内皮細胞(EC)、マクロファージおよび樹状細胞(Mφ/DC)など、正常な頸動脈のさまざまな細胞タイプが同時に検出可能でした。このプロトコルは適切な修正の他のティッシュからの血管の単一細胞懸濁液を準備するのに適用されてもよい。

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease associated with risk factors such as high blood pressure, hyperlipidemia, and hemodynamics1. Carotid artery bifurcations are prone to hemodynamic changes and lead to carotid plaque formation. The clinical presentation of carotid atherosclerosis can be acute such as stroke and transient cerebral ischemia, or chronic such as recurrent transient cerebral ischemia and vascular dementia2. Mechanically, carotid plaque is the outcome of the interaction between different vessel wall cells and various blood cells under pathological conditions. Therefore, revealing the single-cell atlas of carotid vessels under physiological and pathological conditions is particularly important for preventing and treating carotid plaque development.
Single-cell RNA sequencing is one of the most powerful technologies of biological research because of its ultrahigh resolution and detection of cell heterogeneity from the same cell type of organisms3,4. Researchers have used single-cell RNA sequencing to conduct research in many fields, such as cardiovascular disease5 and cancer6. However, quickly and accurately separating tissues into single cells is still one of the main challenges. Enzymatic dissociation is a commonly used method that dominantly includes collagenase, papain, trypsin, DNase, and hyaluronidase. Specifically, collagenases are the major enzyme species for single-cell digestion, mainly hydrolyzing collagen components in connective tissues. Different collagenase types are applicable for the dissociation of different tissues, such as the mammary gland7, glomerulus8, iridocorneal angle9, knee joint10, aorta11, and lung12. Due to the unique physiological properties of different tissues, dissociation using the same method may cause many troubles in acquiring single cells, such as low cell viability, low cell number, and large cell debris. Therefore, the invention of digestion methods for different tissues is essential for preparing high-quality single-cell suspensions.
This protocol aims to develop a two-step cell digestion method to prepare a single-cell suspension of the carotid artery of wild-type mice. According to the characteristics of the carotid artery, we combined collagenase/DNase with trypsin to obtain a high-quality single-cell suspension of the mouse carotid artery because collagenase can hydrolyze collagen of the carotid tissues, which was further digested by trypsin into a single-cell suspension. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) dual-fluorescence counting was used to detect cell viability and concentration, and it was found that the single-cell suspension satisfied the requirements for single-cell sequencing, with the viability of cells over 85% and a high cell concentration. After single-cell data processing, four cell types, including vascular smooth muscle cells (VSMCs), fibroblasts, endothelial cells (ECs), and macrophages and dendritic cells (M&#966;/DCs), were identified in normal mouse carotid arteries after digestion. The advantages of this protocol are that: 1) multiple cell types in the carotid artery can be identified, 2) cell viability is well preserved, and 3) it can be easily repeated without special equipment. This protocol is suitable for researchers who are interested in studying single-cell multiomics of the mouse carotid arteries. This protocol may also be helpful in the dissociation of other blood vessels with appropriate modifications.

著者スポットライト:血管組織の解離と標的治療のための単一細胞サブクラスターの探索 

シングルセルシーケンシングのためのマウス頸動脈からのシングルセル懸濁液の調製

Low solubility and the larger cell debrief are the main difficulties of vascular tissue dissociation. Our two steps or digestion method is very suitable for carotid tissue dissociation and may be used to prepare single cell suspicions for other vessels with minor modifications, making it very helpful in cardiovascular research. This protocol is suitable for obtaining multiple cell types in the carotid artery, and it can be easily repeated without special equipment.In the future, we aim to use cell subclasses discovered by single cell ion sequencing for targeted therapy of cardiovascular disease.

このプロトコルはマウス頸動脈(図1)の単一セル懸濁液を準備するための2段階のセル消化力方法を記述する。この2段階の細胞消化法は、コラゲナーゼ/DNaseとトリプシンを組み合わせて、マウス頸動脈血管壁を効果的に解離させ、シングルセルシーケンシング用の高品質のシングルセル懸濁液を取得します。解離後、細胞濃度および細胞生存率を自動セルカウンターで計?...

Watch this Scientific Journal Video about Vascular Tissue Dissociation and Exploring Single-Cell Subclusters for Targeted Therapy at JoVE.com

ここでは、マウス頸動脈の単一細胞懸濁液を調製するための2段階の細胞消化プロトコルについて説明します。

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are ...

溶解度が低く、細胞の報告が大きいことが、血管組織解離の主な困難である。当社の2つのステップまたは消化法は、頸動脈組織の解離に非常に適しており、軽微な修正で他の血管の単一細胞の疑いを調製するために使用できるため、心臓血管研究に非常に役立ちます。このプロトコルは、頸動脈で複数の細胞タイプを得るのに適しており、特別な機器なしで簡単に繰り返すことができます。将来的には、シングルセルイオンシーケンシングによって発見された細胞サブクラスを心血管疾患の標的治療に利用することを目指しています。

preparation-single-cell-suspension-from-mouse-carotid-arteries-for

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

2.0K ビュー.  Soochow University. 溶解度が低く、細胞の報告が大きいことが、血管組織解離の主な困難である。当社の2つのステップまたは消化法は、頸動脈組織の解離に非常に適しており、軽微な修正で他の血管の単一細胞の疑いを調製するために使用できるため、心臓血管研究に非常に役立ちます。このプロトコルは、頸動脈で複数の細胞タイプを得るのに適しており、特別な機器なしで簡単に繰り?...

ビデオ: 著者スポットライト:血管組織の解離と標的治療のための単一細胞サブクラスターの探索 

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are clogged by plaque. Revealing the cellular composition of the carotid artery at the single-cell level is essential for treating carotid atherosclerosis. However, there is no ready-to-use protocol for the preparation of single-cell suspensions from carotid arteries. To obtain a suitable protocol for the dissociation of normal carotid arteries at the single-cell level with less damage to cells, we designed a two-step digestion method by integrating the digestion process of collagenase/DNase and trypsin. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) dual-fluorescence counting was used to detect cell viability and concentration, and it was found that the single-cell suspension satisfied the requirements for single-cell sequencing, with the viability of cells over 85% and a high cell concentration. After single-cell data processing, a median of ~2500 transcripts per cell were detected in each carotid artery cell. Notably, a variety of cell types of the normal carotid artery, including vascular smooth muscle cells (VSMCs), fibroblasts, endothelial cells (ECs), and macrophages and dendritic cells (M&#966;/DCs), were concurrently detectable. This protocol may be applied to prepare a single-cell suspension of blood vessels from other tissues with appropriate modifications.

Here we describe a two-step cell digestion protocol for preparing a single-cell suspension of mouse carotid arteries.