まず、AAV関連ベクターをマウスの脳に注入します。ウイルス注射の3〜4週間後、麻酔をかけたマウスの首の腹側と背中の部分を剃ります。70%エタノール溶液で3つのヨウ素スクラブをローテーションして、削った部分をきれいにします。
肩甲骨の間の皮膚を腹側切開します。その後、切開部に手術用ガーゼを敷き、頭を外科医の方に向けて仰臥位の状態にします。次に、首の右側、鎖骨の上に小さな垂直切開を行い、右頸動脈と頸静脈を露出させます。
皮下組織を分離した後、右外頸静脈を露出させ、縫合糸を静脈の下に置きます。頸静脈の遠位端を結び切って血流を止めます。マイクロ鉗子とハサミを使用して、崩壊した静脈を小さく切開します。
次に、斜角を下に向けて静脈カテーテルを挿入し、右心房に達するまで上大静脈に向かって近位に動かします。7-0シルク縫合糸を使用して、カテーテルを血管に固定します。結合組織を解剖して、右の総頸動脈を露出させます。
近位に、内頸動脈と外頸動脈が分かれるレベルで固定されていないままの2つの7-0シルク縫合糸の縫合糸ループを事前に配置します。血流を一時的に止めるには、あらかじめ配置した縫合糸ループを引っ張ります。次に、マイクロハサミまたは27ゲージの針を使用して、血管壁に小さな開口部を作成します。
縫合糸ループを解除しながら動脈カテーテルを近位に挿入し、大動脈弁に触れることなくカテーテルを大動脈弓に到達するように前進させます。あらかじめ配置された2つの縫合糸を使用して、カテーテルを血管に固定します。すべてのカテーテルを皮下にトンネルし、事前にカットされた切開部を介して首の後ろで外部化し、腹側切開部を閉じます。
カテーテルを、25ゲージのニードルチューブで作られたシリコンコーティングされたチューブコネクタの静脈ポートまたは動脈ポートに結合します。腹側切開を閉じた後、背中の皮膚を縫合糸で密封した状態でコネクタを皮下に固定します。ステンレス鋼の手術用ワイヤーを使用して、カテーテルにヘパリン処理生理食塩水を満たし、カテーテルの端をしっかりと塞ぎます。
術後24時間で自動採血システムに動物を取り付けるには、テザーフックを首の後ろにある金属リングに接続し、動脈ラインを接続します。動脈カテーテルが注射ラインに接続されたら、静脈カテーテルをサンプリングラインに取り付けます。注射時間と用量を毎分500マイクロリットルで0.5ミリグラム/キログラムに設定します。.
生理食塩水によるサンプル希釈を含む、採血の時間と頻度を設定します。システムは、サンプリングされた血液を置き換えるために、同量の生理食塩水を自動的に補充します。自動プレインジェクションを実行します。
次に、薬物クロザピンN-オキシドの自動静脈内注射を毎分500マイクロリットルの注射速度で行う。次に、注射後の採血を行います。弓状核にAAV-hM3Dq-mCherryの片側性定位固定注射を受けた成人Kiss1-EYFP女性の黄体形成ホルモンパターンが提示されています。
ジストラス黄体形成ホルモンのレベルは一般的に低いですが、その拍動性放出のために通常変動が観察されます。黄体形成ホルモンレベルの急激な上昇は、クロザピンN-オキシド注射に反応して発生します。.Kiss1-EYFPと共局在するほとんどのmCherryニューロンは、ウイルスとニューロンの活性化が標的集団に特異的であることを実証しました。
黄体形成ホルモンの放出の拍動パターンは、ジストラス野生型マウスとそれに続くキスペプチン-10のIP注射に対する反応を示しています。ジストラスの女性に典型的な透明な黄体形成ホルモンパルスが観察され、基礎黄体形成ホルモンレベルが低いことが示されました。黄体形成ホルモンの即時かつ強力な増加は、キスペプチン投与に反応して検出されました。.
