まず、還元的メチル化によってプールされたタンパク質画分を化学的に修飾します。これを行うには、精製したタンパク質を取り、20ミリモルのジメチルアミンボランを加え、続いて40ミリモルのホルムアルデヒドを加えます。混合物を振動シェーカーで摂氏4度で2時間インキュベートします。
次に、混合物にさらに10ミリモルのジメチルアミンボランを加えます。次に、混合物を摂氏4度で12〜18時間一晩インキュベートします。pH 7.5 の 100 ミリモルの塩化トリスを添加して反応を急冷します。
メチル化タンパク質をニッケル-NTAカラムにロードするには、適切な洗浄バッファーと溶出バッファーを使用してください。まず、2 ミリリットルのニッケル NTA カラムを 10 カラム容量の洗浄バッファーで洗浄します。次に、溶出バッファーでタンパク質を溶出します。
溶出後、タンパク質溶出液をPD-10脱塩カラムに通し、適切なバッファーで事前に平衡化します。イソプロパノールまたはエタノールで調製したコレステロールを脱塩タンパク質に加え、4°Cで一晩インキュベートします。翌朝、混合物を 150 、 000 G で 4 °C で 10 分間超遠心分離します。
収集した上清を100キロダルトンのカットオフを備えた遠心濃縮機に加え、上清を30〜50ミリグラム/ミリリットルの最終濃度に濃縮します。もう一度、高速卓上冷蔵遠心分離機を使用して濃縮タンパク質を遠心分離し、ペレットを除去します。採取した上澄み液を摂氏4度の氷上に置いてから、結晶化のセットに進みます。
摂氏4度で保存したアルキル化タンパク質を、1ヶ月かけて分析ゲルろ過クロマトグラフィーで分析しました。そして、1週間後にはわずかなタンパク質の減少が見られました。
